[发明专利]精子特异性阳离子通道蛋白CatSper1的基因疫苗及其制备方法

权利要求书

1.精子特异性阳离子通道蛋白CatSper1的基因疫苗的制备方法，其特征在 于：包括以下步骤：

a、CatSper1和BAFF双基因共表达重组真核载体的构建：将CatSper1全长 cDNA插入含有IRES的双基因共表达真核载体pStar的IRES上游，再将BAFF 全长cDNA插入该真核载体的IRES下游，即得CatSper1和BAFF双基因共表 达重组真核载体；

b、免疫刺激复合物的制备：将CatSper1和BAFF双基因共表达重组真核载 体用磷酸盐缓冲液即PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂， 使每毫升溶液中含有CatSper1和BAFF双基因共表达重组真核载体0.5mg、皂 苷Quil A 1mg、胆固醇0.1mg和卵磷脂0.1mg，冰浴超声处理使溶液充分混匀并 乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的ISCOM，也即CatSper1的基因 疫苗。

2.根据权利要求1所述精子特异性阳离子通道蛋白CatSper1的基因疫苗的 制备方法，其特征在于：所述步骤a的具体方法为：

a1、CatSper1全长cDNA的克隆：提取人成熟精子细胞总RNA，逆转录得 到总cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示序列 为上下游引物，PCR扩增两端分别带有Pst I和EcoR I酶切位点的CatSper1全 长cDNA，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火 1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟；PCR产物经纯 化后克隆入pT-Easy载体，得重组载体pT-CatSper1；

a2、BAFF全长cDNA的克隆：提取人脾脏组织总RNA，逆转录得到总cDNA， 再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示序列为上下游引物， PCR扩增两端分别带有BamH I和Sal I酶切位点的BAFF全长cDNA，PCR条件 为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分钟， 共30个循环；最后72℃延伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pT-Easy载体，得 重组载体pT-BAFF；

a3、重组真核载体的构建：自步骤a1所得重组载体pT-CaSper1中用Pst I和 EcoR I双酶切出CatSper1全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切 的真核载体pStar连接，得重组载体pStar-CatSper1；再自步骤a2所得重组载体 pT-BAFF中用BamH I和SalI双酶切出BAFF全长cDNA，经纯化后与同样用 BamH I和Sal I双酶切的重组载体pStar-CatSper 1连接，即得CatSper 1和BAFF双基 因共表达重组真核载体pStar-CatSper1-IRES-BAFF。