[发明专利]原核表达Arresten蛋白纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白纯化技术，具体为一种原核表达Arresten蛋白的纯 化方法。

背景技术

Arresten因子是Colorado等2000年研究发现的一种强有效的内源性血 管生成抑制因子，是IV型胶原αI链羧基末端NCI结构域多肽片段，其对应 的mRNA编码序列长690bp，肽链由229个氨基酸残基组成，等电点为6.4， 相对分子质量(Mr)为26KD。Arresten因子在人体内广泛分布，特别在胎盘 与肝组织中高表达。利用人体中的Arresten基因制备具有抑制肿瘤血管生成 作用的蛋白质是当前国内外研究开发的重点。专利号：200610012821.2公开 了一种利用内源性血管生成抑制因子Arresten基因制备蛋白的方法。中国医 药2009年10月第4卷第10期，740-742页，也发表了关于内源性血管生成 抑制因子Arresten克隆表达的论文。该技术方案的特点是，从健康产妇胎盘 组织中提取总RNA，经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到Arresten 基因，将Arresten基因定向插入表达载体得到连接反应产物，最后将产物转 化入宿主菌大肠杆菌中表达，得到原核表达的Arresten蛋白；Arresten蛋 白分子量约为26KD，表达产物主要以包涵体的形式存在。

以包涵体形式表达的蛋白质可以防止蛋白酶对目的蛋白的降解，并且有 利于表达产物的纯化。包涵体中重组蛋白处于部分变性状态，因而不具有同 野生蛋白一样的生物学活性，因此包涵体必须经过溶解成单体，再通过复性， 才可能使部分蛋白恢复其天然构想，具有生物学活性。按照专利号： 200610012821.2专利技术方案中的纯化技术，蛋白的纯度达到40.5％左右。 但是该纯度还达不到技术人员的理想要求。

发明内容

本发明为了解决现有Arresten蛋白制备技术中存在的蛋白获得纯度低 这一问题，而提供了一种原核表达Arresten蛋白的纯化方法。

本发明是由以下技术方案实现的，一种原核表达Arresten蛋白纯化方法， 步骤为超声法破菌获得包涵体，包涵体尿素洗涤后加入Lysis buffer B裂解， 吹打混匀，温和振荡溶解10min，室温静置20min至溶液变为半透明状态， 离心沉淀细胞碎片，保留上清液。以0.5-1ml/min的流速上样于预先平衡好的 (10倍柱体积Wash buffer B₂平衡)Ni²⁺-NTA纯化柱，室温静置30min，然 后用1倍柱体积的Lysis buffer B洗柱，保持流速在0.5-1ml/min，将纯化柱侧 壁上的残留样品洗去。用5倍柱体积Wash buffer B₂洗杂，洗涤过程中保持流 速在1-2ml/min，用5倍柱体积的Elution buffer A₃洗脱，保持流速在1-2 ml/min。收集洗脱液，最终洗脱得到纯度约97.3％的目的蛋白。经免疫印迹 分析证实该纯化产物为Arresten蛋白。

附图说明

图1显示为变性条件下pH梯度洗脱SDS-PAGE

泳道1：经Elution bufferA₁洗脱的纯化产物；泳道2：经Elution bufferA₂洗脱的纯化产物

泳道3：经Elution bufferA₃洗脱的纯化产物；泳道4：经Elution bufferA₄洗脱的纯化产物

图2显示为变性条件下咪唑梯度洗杂SDS-PAGE(A)

泳道1、5：Wash buffer B₂洗杂纯化产物；泳道2、3：Wash buffer B₁洗杂纯化产物

泳道4：低分子量标准蛋白质

图3显示为变性条件下咪唑梯度洗杂SDS-PAGE(B)

泳道1：低分子量标准蛋白质；泳道2：Wash buffer B₃洗杂纯化产物；

泳道3：Wash buffer B₄洗杂纯化产物

图4显示为纯化产物免疫印迹分析结果

图5显示为纯品Arresten蛋白载体膜下血管生成情况