[发明专利]由冬虫夏草菌中分离得到的蛋白水解酶及其纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的蛋白水解酶及其纯化方法，特别是涉及一种由冬虫夏草菌中分离得到的蛋白水解酶及其纯化方法。

背景技术

酶是生物体组织或细胞内具有特殊催化活性的一类蛋白质。其中蛋白水解酶是水解蛋白质肽键的一类酶，在生物体内发挥着重要的生理功能，例如血液凝固、血纤维溶解、补体激活、多肽和蛋白激素或组织激肽的释放，细胞的融合与分化以及大分子的装配等等。蛋白水解酶也被广泛地应用于生产和生活的各个方面。全球60％以上的商业或工业用酶都是蛋白水解酶(Rao MB et al.，Microbiol Mol Biol Rev1998；62：597-634.)。

目前，全球生产的酶中有大约40％来自微生物，其中很大一部分来自于细菌，尤其是杆菌属。由于对蛋白水解酶，特别是具有特殊性质的蛋白水解酶的需求不断增加，使人们开始寻找新的蛋白水解酶来源。真菌由于其含有大量蛋白水解酶，易于培养，液体培养基过滤方便等原因成为备受关注的新的蛋白水解酶来源(Phadatare SU et al.，Enz Microb Technol 1993；15：72-76)。

冬虫夏草菌(Cordyceps Sinensis)是麦角科虫草属的真菌，在自然界中寄生于虫草蝙蝠蛾(Hepialusarm oricanus)等昆虫幼虫体内形成复合体，被称为冬虫夏草，具有补肺益肾、止血化痰之功效，可主治气短喘咳，自汗盗汗，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后久虚不复等症，是中国传统的珍贵中药。冬虫夏草菌与冬虫夏草的功效相似，富含虫草素、虫草酸、虫草多糖等多种有效生物活性成分(Noh EM et al.，Rheumatology 2009；48：45-48)。目前的研究发现冬虫夏草菌具有肿瘤抑制、免疫激活、抗辐射等作用(Wu JY et al.，Phytomedicine2007；14：43-49)，是一种非常具有药用价值的真菌。

发明内容

本发明的目的在于从冬虫夏草菌中纯化出一种具有特异酶切位点的全新的蛋白水解酶，其可以很好地应用于实验室及工业生产。

本发明的一种蛋白水解酶，是由冬虫夏草菌(CordycepsSinensis)中分离得到的。进一步，所述蛋白水解酶的分子量为43kDa，最适温度为30℃，最适pH为9.5。

本发明的另一目的是提供上述蛋白水解酶的纯化方法：

一种蛋白水解酶的纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：(1)将冬虫夏草菌破碎，并用Tris-HCl缓冲液浸泡；(2)将所述步骤(1)中所得到的浸泡液在18000rpm下离心30分钟；(3)将所述步骤(2)中所得到的离心上清使用HiTrap Q XL离子交换柱进行离子交换层析；(4)将步骤(3)中所得到收集液使用Superdex 200 prep grade分子筛层析柱进行分子筛层析；(5)对步骤(4)所得收集液进行浓缩；(6)对步骤(5)所得收集液进行自然胶电泳，并电洗脱回收蛋白；(7)对步骤(6)所得收集液进行脱盐，冻干；(8)对步骤(7)所得干粉溶解并使用SOURCE 15RPC反相层析柱进行反向层析。

优选地，在所述步骤(1)中，将冬虫夏草菌粉碎后采用以10倍的质量/体积比加入20mM Tris-HCl，PH7.4，4℃搅拌24小时。

优选地，在所述步骤(3)中，先将浸泡液调节为20mM Tris-HClPH7.4，并在离子交换层析前再次调节PH到7.4。

优选地，在所述步骤(3)中，先用平衡缓冲液20mM Tris-HCl，PH 7.4洗脱到基线，然后采用梯度洗脱的方法，用含0-1M NaCl的20mM Tris-HCl，PH 7.4进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰。

优选地，在所述步骤(4)中，进行分子筛层析的洗脱剂是含500mMNaCl的20mM Tris-HCl，PH 7.4。

优选地，在所述步骤(6)中所用的自然胶电泳胶是12％的分离胶和4％的浓缩胶，电泳缓冲液和电洗脱缓冲液为Tris-Gly。

优选地，在所述步骤(8)中，先用2％乙腈洗脱到基线，然后采用梯度洗脱的方法，用2％-70％的乙腈进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰。

本发明的优点是：