[发明专利]由冬虫夏草菌中分离得到的蛋白水解酶及其纯化方法

权利要求书

1.一种蛋白水解酶，其特征在于：该蛋白水解酶是由冬虫夏草菌(Cordyceps Sinensis)中分离得到的。

2.根据权利要求1所述的蛋白水解酶，其特征在于：所述蛋白水解酶的分子量为43kDa，最适温度为30℃，最适pH为9.5。

3.一种蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：所述纯化方法包括以下步骤：

(1)将冬虫夏草菌破碎，并用Tris-HCl缓冲液浸泡；

(2)将所述步骤(1)中所得到的浸泡液在18000rpm下离心30分钟；

(3)将所述步骤(2)中所得到的离心上清使用HiTrap Q XL离子交换柱进行离子交换层析；

(4)将步骤(3)中所得到收集液使用Superdex 200 prep grade分子筛层析柱进行分子筛层析；

(5)对步骤(4)所得收集液进行浓缩；

(6)对步骤(5)所得收集液进行自然胶电泳，并电洗脱回收蛋白；

(7)对步骤(6)所得收集液进行脱盐，冻干；

(8)对步骤(7)所得干粉溶解并使用SOURCE 15RPC反相层析柱进行反向层析。

4.根据权利要求3所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，将冬虫夏草菌粉碎后采用以10倍的质量/体积比加入20mM Tris-HCl，PH7.4，4℃搅拌24小时。

5.根据权利要求3或4所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，先将浸泡液调节为20mM Tris-HCl PH7.4，并在离子交换层析前再次调节PH到7.4。

6.根据权利要求5所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，先用平衡缓冲液20mM Tris-HCl，PH 7.4洗脱到基线，然后采用梯度洗脱的方法，用含0-1M NaCl的20mM Tris-HCl，PH 7.4进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰。

7.根据权利要求3所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，进行分子筛层析的洗脱剂是含500mM NaCl的20mMTris-HCl，PH7.4。

8.根据权利要求3所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：在所述步骤(6)中所用的自然胶电泳胶是12％的分离胶和4％的浓缩胶，电泳缓冲液和电洗脱缓冲液为Tris-Gly。

9.根据权利要求3所述的蛋白水解酶的纯化方法，其特征在于：在所述步骤(8)中，先用2％乙腈洗脱到基线，然后采用梯度洗脱的方法，用2％-70％的乙腈进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰。