[发明专利]油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及农业和植物检疫技术领域，具体涉及一种油菜茎基溃疡病 菌的检测方法，尤其涉及一种油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检测方 法。此外，本发明还涉及检测油菜茎基溃疡病菌的引物和探针。

背景技术

油菜黑胫病(Phoma stem canker)又称为“油菜黑腿病”，是世界范围 内油菜最严重的真菌病害之一，其病原菌为小球腔菌属，主要包括两个种： 油菜黑胫病菌Leptosphaeria biglobosa和油菜茎基溃疡病菌Leptosphaeria  maculans，这两种病原菌的形态特征相近，但引起油菜茎部感染和基部溃 疡的能力不同。前者致病力较弱，一般引起茎中上部为害，造成的损失小， 包括中国在内的一些油菜生产国均有分布。后者致病力强，引起茎基部发 病，是导致油菜黑胫病严重流行和油菜产量损失的主要因素，在澳大利亚、 加拿大、美国、欧洲等油菜主产国有分布，而在我国未见报道。我国油菜 产区气候与欧、美、澳三大洲相似，且中国目前的油菜主要栽培品种高度 感病。另一方面，随着贸易全球化，病菌传入的风险加剧。2009年8月 以来，上海口岸已经从澳大利亚、乌克兰和加拿大等国进境油菜籽样品中 多次截获油菜茎基溃疡病菌L.maculans。油菜茎基溃疡病菌正在一步步 逼近我国，严重威胁着我国油菜产业的生产安全。为防止该有害生物的传 入，如何高效快速检测成为预防油菜茎基溃疡病传入国内的技术关键。

目前，国内针对油菜茎基溃疡病菌的检测方法研究较少，采用的检测 手段主要是滤纸培养法和PCR方法，PCR检测方法以其快速、准确和灵 敏的特点受到广泛应用。但尚未见利用MGB探针来检测油菜茎基溃疡病 菌的实时荧光PCR检测方法的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种油菜茎基溃疡病菌的实时荧光 PCR检测方法；为此，本发明还提供用于上述方法的检测引物和探针。

在本发明的一方面，提供一种油菜茎基溃疡病菌的实时荧光PCR检 测方法，包括如下步骤：

(1)设计引物和探针；

该引物的序列为：

Lmb3：5’-caccaattggatccccta-3’(SEQ ID NO.1)或其互补链；

R2：5’-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3’(SEQ ID NO.2)或其互补链；

该探针的序列为：

Probe-M：5’-FAM-cacttgggactcgccttg-MGB-3’(SEQ ID NO.3)或其 互补链；

(2)对油菜籽样品进行过筛处理，然后收集菌丝并提取DNA；

(3)采用步骤(1)设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测。

步骤(2)中，所述对油菜籽样品进行过筛处理具体为：用孔径2.5mm 和1.5mm的网筛过筛，取筛上物和筛下物，液氮研磨后取样。

步骤(2)中，所述收集菌丝并提取DNA具体为：菌株用PDA培养 基繁殖后收集菌丝，液氮研磨后取菌丝粉，用植物基因组提取试剂盒提取 DNA。

步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL，包括12.5 μL 2×Premix Ex Taq、5μM步骤(1)设计的引物和探针各1μL、1μL模 板DNA、0.5μL 50×ROX Reference Dye II、加无菌水补至25μL。

步骤(3)中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：95℃预变性 10s，然后以95℃变性15s，60℃延伸1min进行40个循环的扩增。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的引物， 其序列为：

上游引物Lmb3：5’-caccaattggatccccta-3’(SEQ ID NO.1)或其互补 链；

下游引物R2：5’-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3’(SEQ ID NO.2)或其互补 链。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测油菜茎基溃疡病菌的探针， 其序列为：Probe-M：5’-FAM-cacttgggactcgccttg-MGB-3’(SEQ ID NO.3) 或其互补链。