[发明专利]一种SecA ATPase抑制剂的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种SecA ATPase抑制剂的筛选方法。

背景技术

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)，又名绿脓杆菌，是假单胞菌属中的代表菌种。绿脓杆菌是一种非发酵革兰氏阴性细菌，其营养要求不高，广泛分布于医院内各种环境。它可以引起多种类型的感染，如菌血症、肺炎、腹内感染、伤口感染、烧伤感染、尿路感染等。由于其外膜通透性低并存在着外排多种物质的主动外排系统(Active Efflux Systems)，因此多为天然耐多种抗生素菌株，感染后不易被控制。绿脓杆菌对有并发症、使用插入式导管、进行外科手术后的病人感染力特别强。研究显示，医院感染中超过60％的死亡率都与绿脓杆菌相关。绿脓杆菌通过感染病人，毒力可以增强；它甚至能攻击原是健康的人们，引起败血症、心内膜炎、脑脊髓膜炎、胸膜炎、盆腔炎、肾炎、胰腺炎等。由此可见，绿脓杆菌是一种重要的院内感染条件致病菌，是烧伤、外科手术后呼吸道感染中的主要因素。目前的临床治疗策略包括广谱抗生素的使用(如氟喹诺酮类、氨基糖苷类、碳青霉烯类、三代头孢菌素)和革兰氏阴性菌选择性药物的使用(如氨曲南和哌拉西林)，近年来又推出了β-内酰胺类抗生素联合氨基糖苷类或者氟喹诺酮类联合治疗。但是，广谱抗生素的大量使用以及药物的联合治疗导致了多药耐药株以及泛耐药株的急速出现。近年来，除了多尼培南外没有新的抗绿脓杆菌药物入市。因此，迫切需要发现新型低毒、高效抗绿脓杆菌药物。

从成千上万个微生物代谢产物或其它来源的天然产物中筛选所 需的抗菌药物是非常艰难的一个过程。目前开发新型有用的天然产物药物，虽然仍有很大的潜力，但研究工作的难度越来越大，耗时越来越长，需要的资金也越来越多。为摆脱筛选的盲目性，提高效率，有必要进行定靶筛选，从细菌生存所必须的组成成分或者临床有效抗生素的作用机理和细菌的耐药机理来设计筛选模型，有目的地筛选具有某种作用机理的抗生素，试图获得抗菌作用强、对耐药菌有效、毒性小的新抗生素。

Sec途径(即分泌途径secretion pathway)是蛋白质转运的主要途径。其中，SecA ATPase是蛋白质转运途径中的“动力泵”，它通过ATP的水解循环驱使蛋白质前体穿过细菌内膜，在细菌中是独有且不可缺少的。将SecA作为筛选抗菌药物的靶点，有望建立有效的抗菌药物筛选模型。然而，该项工作进展缓慢，到目前为止仍然没有有关可行方案的报道。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种SecA ATPase抑制剂的筛选方法。

本发明方法包括如下步骤：

1)配置如下反应体系：

反应物        终浓度

Hepes         90～110mM

MgCl₂         9～11mM

MnCl₂         1.8～2.2mM

ATP           9～11mM

PEP           0.9～1.1mM

NADH          1.3～1.7mM

SecAATPase    2.5～3.5μg/100μl

丙酮酸激酶    1.6～2.0U/100μl

乳酸脱氢酶    1.6～2.0U/100μl

2)设置如下各反应组：

i)样品实验组：向1)所述反应体系中加入适量已知浓度的样品溶液；

ii)阳性对照组：用等体积ddH₂O代替1)所述反应体系中的SecAATPase，抑制率设为100％，该组表征SecA ATPase的活性被完全抑制；

iii)阴性对照组：向1)所述反应体系中加入等量的i)所述样品溶液中除样品本身外的溶剂及溶质；

3)反应开始后，测定各反应组OD₃₄₀吸光值变化量，计算反应抑制率，对反应具有抑制作用的即为阳性样品。

上述步骤1)优选反应体系为：

反应           物终浓度

Hepes          100mM

MgCl₂          10mM

MnCl₂          2mM

ATP            10mM

PEP            1mM

NADH           C1.5mM