[发明专利]一种SecA ATPase抑制剂的筛选方法

权利要求书

1.一种筛选SecAATPase抑制剂的方法，包括如下步骤：

1)配置如下反应体系：

反应物        终浓度

Hepes         90～110mM

MgCl₂         9～11mM

MnCl₂         1.8～2.2mM

ATP           9～11mM

PEP           0.9～1.1mM

NADH          1.3～1.7mM

SecA ATPase   2.5～3.5μg/100μl

丙酮酸激酶    1.6～2.0U/100μl

乳酸脱氢酶    1.6～2.0U/100μl

2)设置如下各反应组：

i)样品实验组：向1)所述反应体系中加入适量已知浓度的样品溶液；

ii)阴性对照组：用等体积ddH₂O代替1)所述反应体系中的SecAATPase；

iii)阳性对照组：向1)所述反应体系中加入等量的i)所述样品溶液中除样品本身外的溶剂及溶质；

3)反应开始后，测定各反应组OD₃₄₀吸光值变化量，计算反应抑制率，对反应具有抑制作用的即为阳性样品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系为：

反应物     终浓度

Hepes      100mM

MgCl₂      10mM

MnCl₂      2mM

ATP        10mM

PEP        1mM

NADH          1.5mM

SecA ATPase   3μg/100μl

丙酮酸激酶    1.8U/100μl

乳酸脱氢酶    1.8U/100μl。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步骤2)中样品为化合物时，向200μl反应体系中加入1μl 5mg/ml的样品溶液作为样品实验组；当样品为发酵液时，按照10μl发酵液挥干后制成1μl的样品溶液，加入反应体系作为样品实验组。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中步骤3)将2)各组反应体系分别混匀后加入同一块96孔板中，置于酶标仪内，开启温控为37℃进行反应，以反应起始时间为0时刻，每隔2分钟检测一次各孔反应体系在340nm波长处的吸光值OD₃₄₀，连续检测50min，

结果分析：

分别计算各孔的ΔOD₃₄₀/min，

再依公式抑制率IR=ΔN-ΔSΔN-ΔP×100%]]>计算各孔的抑制率；

其中：

ΔN是阴性对照孔平均每分钟吸光值的变化量，

ΔP是阳性对照孔平均每分钟吸光值的变化量，

ΔS是样品实验孔平均每分钟吸光值的变化量。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，抑制率大于30％的样品为阳性样品。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述SecA ATPase为PaSecAN68蛋白。