[发明专利]表达PCV-2免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达PCV-2免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属，是圆环病毒属的代表种， 它是一种小而无囊膜、二十面体对称、共价闭合、环状、单股DNA病毒，病 毒粒子直径平均为17nm，是目前兽医学上发现的最小的动物病毒。

PCV可分为两个血清型，即PCV-1和PCV-2。PCV-1对猪无致病性，为非 致病性PCV，PCV-2对猪有致病性，可引起PMWS(断奶仔猪多系统衰竭综合 征)，又称PMWS相关PCV。1991年加拿大首次爆发该病，随后世界上许多国 家和地区都有该病的报道，目前我国的很多猪场均有该病存在，给我国的养猪 业造成严重的经济损失。

Hamel等通过对PCV基因组分析，发现PCV-1和PCV-2均可能含有11个 开放阅读框(0RF)。PCV各阅读框中，ORF1和ORF2为主要阅读框，现已证 实ORF1编码是与病毒复制相关的Rep蛋白，而PCV-2的ORF2基因编码病毒 核衣壳蛋白(Cap)，也是病毒的保护性抗原。Liu等将ORF2基因连接到 MBP-His(8)-tag基因3’端，在细菌中表达ORF2融合蛋白，发现该融合蛋白可 被抗PCV-2多克隆抗体和PCV-2感染猪血清识别，表明ORF2蛋白与PCV-2 的免疫反应性有关。Truong等用从实验性感染猪制备的PCV-2抗血清，建立 ELISA方法，发现PCV2-ORF2编码蛋白具有与抗原性相关的线性表位，其中 从69-83和117-131残基的两个抗原表位对PCV-2来说具型有特异性，ORF2 抗原表位可以作为PCV-2感染的血清学标志以检测PCV-2抗体效价。

PCV-2是目前严重威胁养猪业发展的一种重要的病毒。目前对PCV-2的控 制目前尚无疫苗。因此发展新型疫苗来控制PCV-2已是当务之急。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种重组杆状病毒及可作为预防PCV-2感 染的亚单位疫苗。

本发明提供的一种表达PCV-2免疫原基因的重组杆状病毒，带有SEQ ID NO.1所示的序列。所述重组杆状病毒表面展示PCV-2结构蛋白ORF2。

本发明提供一种上述的重组杆状病毒的制备方法，步骤包括：

a、制备ORF2基因。制备方法为：用PCR方法扩增了PCV-2陕西株ORF2 基因，并将其克隆到pMD18-T载体，构建了pMD18T-ORF2质粒；

b、将PCV-2的ORF2基因，插入到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC的 p10启动子下游，构建含PCV-2的ORF2基因的重组杆状病毒转座质粒 pBacSC-ORF2；

c、将上述重组杆状病毒转座质粒pBacSC-ORF2转入大肠杆菌内进行同源 重组，获得重组杆状病毒基因组DNA。作为优选，所述大肠杆菌为感受态大肠 杆菌DH10Bac。

d、将步骤c得到的重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒。 优选地，将重组杆状病毒DNA通过脂质体介导方法转入昆虫细胞Sf9中，包装 出重组杆状病毒。

本发明提供一种上述的重组杆状病毒在制备猪圆环病毒疫苗中的应用。

本发明提供一种制备猪圆环病毒疫苗的方法：所述重组病毒接种昆虫细胞， 培养48～72h，收取感染细胞，-40℃/37℃冻融，离心，取上清测定病毒PFU， 调整病毒的滴度使其达到10⁹PFU/ml。上述昆虫细胞优选Sf9昆虫细胞。

本发明的优点和积极效果为：

1、本发明得到的重组杆状病毒BacSC-ORF2可表面展示PCV-2结构蛋白 ORF2，直接经过超速离心得到杆状病毒的同时也就得到了目的蛋白，可以避免 现有技术中表达系统(包括传统的杆状病毒表达系统)表达目的蛋白分离纯化 的繁琐过程。而，现有技术的表达系统中表达的目的蛋白是分泌到Sf9细胞的 培养基中，需要通过蛋白纯化系统来纯化目的蛋白，这样费时费力，代价昂贵， 不能大规模应用于目的蛋白的规模化生产，这也是目前蛋白表达最令人头疼的 地方。

2、转座载体中添加eGFP基因，可以通过荧光显微镜直接观察荧光的有无 来检测重组病毒的产生情况，大大简化病毒滴度的测定。

3、该重组杆状病毒表面展示的蛋白可与PCV-2抗体发生特异性反应。