[发明专利]表达PCV-2免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用

权利要求书

1.一种表达PCV-2免疫原基因的重组杆状病毒，其特征在于，所述重组杆状病毒带有SEQ ID NO.1所示的序列，所述重组杆状病毒表面展示PCV-2结构蛋白ORF2，

所述重组杆状病毒的制备方法，步骤包括：

a、制备SEQ ID NO.1所示的ORF2基因；    

b、将上述的ORF2基因，插入到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC的p10启动子下游，构建含PCV-2的ORF2基因的重组杆状病毒转座质粒pBacSC-ORF2；

c、将上述重组杆状病毒转座质粒pBacSC-ORF2转入大肠杆菌内进行同源重组，得重组杆状病毒DNA；

d、将步骤c得到的重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒;

其中，所述pBacSC载体的构建过程：

1.1    引物的设计

根据发表的如GenBank: AY542374所示的杆状病毒AcMNPV的gp64基因组序列和如GenBank：EU048697所示的绿色荧光蛋白（eGFP）基因的基因组序列，设计3对特异性引物Pl/P2、P3/P4、P5/P6;

上游引物P1   5'- TCACCCGGG ATGCTACTAGTAAATCAGTCACACCAAGGCTTCAATAAGGAACACACAAGCAAGATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTG-3'，5' 端加上 SmaI酶切位点；下游引物P2   5'- GTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGCGCACCACCACCACCACCACGCGCGCCCATGGGCTAGCGCATGCGCATGC -3'；上游引物P3   5'- GCGCGCCCATCGCATGCTTCAGGGCTAGTGTTTGGTCATGTA -3' ； 下游引物P4  5'- CCC GGTACCTTAATATTGTCTATTAC -3'，5' 端加上 Kpn I酶切位点；预期扩增片断为267bp，含有GP64 信号肽（SP）序列，6个组氨酸（His6）标签，4个多克隆位点，即BsshI、NcoI、NheI、SphI，GP64 跨膜区（TM）和GP64胞质区（ CTD）基因；

上游引物P5  5'- GCTGGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT -3'，5'端加上 BamHI酶切位点；下游引物P6  5'- AAGCTT CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA -3'，5' 端加上HindIII酶切位点，预期扩增片断为717bp，含有完整的绿色荧光蛋白基因（eGFP）基因；

1.2    如SEQ ID NO.2所示的 SP－His6－四个酶切位点－TM－CTD 序列的扩增：

PCR反应体系如下：10×PCR Buffer 5μL、dNTPs 4μL、P1/P2 ，P3/P4各1μL、Taq DNA多聚酶1μL、加水至50μL，反应程序：95℃变性5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 30sec，共30个循环；最后72℃延伸10min，反应结束后取10μL PCR产物加入1μL 6×Loading Buffer于0.8%琼脂糖凝胶电泳，分析扩增产物；

1.3    eGFP基因的扩增：

PCR反应体系如下：10×PCR Buffer 5μL、dNTPs 4μL、P5/P6各1μL、Taq DNA多聚酶1μL、pEGFP-C1质粒1μL、加水至50μL，反应程序：95℃变性5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 2min，共30个循环；最后72℃延伸10min，反应结束后取10μL PCR产物加入1μL 6×Loading Buffer于0.8%琼脂糖凝胶电泳，分析扩增产物；

1.4     PCR产物与pFastBacTM Dual载体的连接

参照上海生工UNIQ-10胶回收试剂盒说明书回收目的基因，将eGFP基因插入载体pFastBacTM Dual的Polyhedrin 启动子下游的多克隆位点（MCS）的BamHI和HindIII酶切位点处，同样方法将SP－His6－四个酶切位点－TM－CTD基因插入到已经插入了eGFP基因的pFastBacTM Dual载体的另外一个p10 启动子下游多克隆位点（MCS）的SmaI和KpnI酶切位点处，从而构建成功pBacSC载体。