[发明专利]表达PRRSV免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种表达PRRSV免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用。

背景技术

PRRS(猪繁殖与呼吸综合症)是由PRRSV(猪繁殖与呼吸综合症病毒)引起的 猪的烈性传染病之一。被国际兽医局列为B类动物传染病，主要引起母猪繁殖 障碍(如流产、早产、死胎、木乃伊胎)和仔猪呼吸道症状。

目前世界上发生的PRRS有两个血清型：欧洲型和美洲型。到目前为止我 国流行的只有美洲型。由于PRRS主要是引起母猪的繁殖障碍，从而给我国养 猪业造成了巨大的经济损失。

PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，是不分节段的单股正链RNA 病毒。基因组长约15Kb，具有感染性，含有8个开放阅读框(ORF)。其中ORF3 和ORF5是主要的结构蛋白基因，编码的糖蛋白GP3和GP5是PRRSV主要的 免疫原。既可诱导体液免疫，又可诱导细胞免疫。

PRRSV是目前严重威胁养猪业发展的一种重要的病毒，目前对PRRS疾病 的控制尚无切实有效的方法，防制PRRS的疫苗主要有灭活苗和弱毒苗，但由 于免疫原性和安全性等方面的问题受到限制。因此发展新型疫苗来控制PRRSV 已是当务之急。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种重组杆状病毒及可作为预防PRRS感 染的亚单位疫苗。

本发明提供的表达PRRSV免疫原基因的重组杆状病毒，带有SEQ ID NO.1 所示的序列。所述重组杆状病毒表面展示PRRSV结构蛋白GP3。

本发明提供一种上述的重组杆状病毒的制备方法，步骤包括：

a、制备ORF3基因。制备方法为：用PCR方法扩增了PRRSV陕西株ORF3 基因，并将其克隆到pMD18-T载体，构建了pMD18T-ORF3质粒；

b、将PRRSV的ORF3基因，插入到杆状病毒表面展示转座载体pBacSC 的p10启动子下游，构建含PRRSV的ORF3基因的重组杆状病毒转座质粒 pBacSC-ORF3；

c、将上述重组杆状病毒转座质粒pBacSC-ORF3转入大肠杆菌内进行同源 重组，获得重组杆状病毒基因组DNA。作为优选，所述大肠杆菌为感受态大肠 杆菌DH10Bac。

d、将步骤c得到的重组杆状病毒DNA转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒。 优选地，将重组杆状病毒DNA通过脂质体介导方法转入昆虫细胞Sf9中，包装 出重组杆状病毒。

本发明提供一种上述的重组杆状病毒在制备猪繁殖与呼吸综合症病毒疫苗 中的应用。

本发明提供一种制备猪繁殖与呼吸综合症病毒亚单位疫苗的方法：重组病 毒接种昆虫细胞，培养48～72h，收取感染细胞，-40℃/37℃冻融，离心，取上 清测定病毒PFU，调整病毒的滴度使其达到10⁹PFU/ml。上述昆虫细胞优选Sf9 昆虫细胞。

本发明的优点和积极效果为：

1、本发明得到的重组杆状病毒BacSC-GP3可表面展示PRRSV结构蛋白 GP3，直接经过超速离心得到杆状病毒的同时也就得到了目的蛋白，可以避免 现有技术中表达系统(包括传统的杆状病毒表达系统)表达目的蛋白分离纯化 的繁琐过程。而，现有技术的表达系统中表达的目的蛋白是分泌到Sf9细胞的 培养基中，需要通过蛋白纯化系统来纯化目的蛋白，这样费时费力，代价昂贵， 不能大规模应用于目的蛋白的规模化生产，这也是目前蛋白表达最令人头疼的 地方。

2、转座载体中添加eGFP基因，可以通过荧光显微镜直接观察荧光的有无 来检测重组病毒的产生情况，大大简化病毒滴度的测定。

3、该重组杆状病毒表面展示的蛋白可与PRRSV抗体发生特异性反应。

4、本发明得到的一株重组杆状病毒BacSC-GP3可刺激小鼠产生有效的体 液免疫和细胞免疫。

5、本发明得到的一株重组杆状病毒BacSC-GP3对实验动物是安全的，无 任何病理现象出现。

6、本发明得到的一株重组杆状病毒具有很好的遗传稳定性，经多次传代后 外源基因不丢失。

7、本发明所使用的目的基因为PRRSV(美洲株，自陕西分离)国内分离株， 从而构建的重组杆状病毒可作为我国预防PRRS的亚单位疫苗。

附图说明

图1是重组转座质粒pBacSC-ORF3构建流程图。