[发明专利]偶联生物分子及其制备

说明书

本申请是2004年7月12日提交的申请号为200480019814.4 (PCT/GB2004/002994)之申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及偶联生物分子以及由聚合物如聚乙二醇的新型化学官能化衍生物制 备该偶联生物分子。

背景技术

许多治疗活性分子不具有在临床医学应用上实现功效所需要的性质。例如，目前 生物制药工业和遗传工程正在不断地发现和生产具有治疗活性的蛋白质和多肽。尽管 目前在美国市场上存在至少80种蛋白质基药物，并且还有至少350种蛋白质基药物 正在进行临床试验(Harris J，Chess R：Effect of Pegylation on pharmaceuticals. Nature Review Drug Discovery，2003，2，214-221)，但是大多数天然蛋白质并没有制出 好药物，这是因为在向患者施用时存在几个固有缺陷，包括(1)蛋白质被存在于血 液或组织中的许多内肽酶和外肽酶所消化，(2)许多蛋白质在一定程度上是免疫原性 的，以及(3)蛋白质可以通过肾超滤作用被快速排泄。医药中用作活性治疗剂的、 具有全身毒性或缺乏最佳生物利用度和药代动力学的其它分子包括有效剂量受到毒 性限制的低分子量分子。这种分子常用于治疗由于癌变、感染和自身免疫疾病而导致 的炎症和病症。

水溶性的合成聚合物，尤其是聚亚烷基二醇，用于偶联治疗活性分子如蛋白质。 已经表明，这些治疗偶联物通过延长循环时间和降低清除率来有利地改变药代动力 学、降低全身性毒性，并在一些情况下表现出临床药效的提高。使聚乙二醇PEG共 价偶联至蛋白质上的方法通常称作“聚乙二醇化(PEGylation)”，不过许多不同的聚 合物也已被作为偶联聚合物进行研究。

许多用于偶联的聚合物试剂包括水解不稳定的偶联化学官能团。水解不稳定的聚 合物偶联剂的实例是活化酯，例如包括聚环氧烷-N-琥珀酰亚胺碳酸酯(Zalipsky美国 专利No.5,122,614)。这些试剂在水性介质中具有较短的半寿期，所述水性介质包括 血液或血浆。这导致需要加入化学计量上大量过量的偶联聚合物试剂。试剂的水解稳 定性是重要的，因为对于蛋白质偶联加入化学计量上过量的要求需要大量的努力和成 本，以从反应混合物中纯化聚合物-蛋白质偶联物。此外，这些水解不稳定的试剂倾向 于优选与蛋白质中的胺化学官能团进行反应，尤其是赖氨酸残基的ε-胺。由于大多数 相关的蛋白质具有多于一个赖氨酸残基，并经常具有许多赖氨酸残基，因此偶联倾向 于在蛋白质上的许多残基位点上发生，而不是特异的。可以纯化偶联反应混合物以分 离与一个聚合物分子偶联的蛋白质，但是不能以合理的成本分离全部与蛋白质上相同 胺基偶联的聚合物-蛋白质偶联物。非特异偶联通常导致蛋白质功能的削弱。例如，通 过赖氨酸残基随机结合聚环氧烷的抗体和抗体片段导致修饰型抗体(或修饰型抗体片 段)能够以降低的亲和性、亲抗原性或特异性结合目标抗原。另外，胺特异性聚合物 偶联剂需要选择确保蛋白质上的胺不被质子化的偶联反应条件。这些条件需要适当高 pH的介质(8-10)，这使得胺基具有足够的活性与聚合物偶联剂反应。高pH条件通 常对蛋白质是有害的，引起蛋白质的结构变化和变性。这些过程导致蛋白质功能的削 弱。胺特异性聚合物偶联剂倾向于结合至蛋白质上可接近的胺位点。这些试剂可以称 为动力学试剂(kinetic reagent)。它们是不稳定的，与蛋白质上最可接近的氨基亲核 位点反应。通过胺酰化作用偶联的胺特异性聚合物偶联剂导致蛋白质上氨基酸残基的 胺基团上正电荷的丢失，所述正电荷通常在生理条件下存在于未偶联蛋白质。胺特异 性聚合物偶联剂的这些特征通常导致蛋白质功能的部分削弱。包含在聚合物中、用于 偶联至蛋白质、胺特异性的并且通常水解不稳定的其他偶联功能基团包括异氰酸酯 (WO 94/04193)和碳酸酯(WO 90/13540)。

确保每个蛋白质上偶联聚合物分子的数目相同并且每个聚合物分子特异性地共 价偶联至每个蛋白质分子中相同的氨基酸残基上，这对于最佳功效和确保剂量之间一 致性来说是尤其相关的。沿着蛋白质分子上位点处的非特异性偶联导致偶联产物散 布，并经常导致未偶联蛋白质而得到一种复杂混合物，要纯化所述复杂混合物是困难 的、繁重的且昂贵的。