[发明专利]一种重复模块基因拼接方法

说明书

技术领域

本发明属基因拼接领域，特别是涉及一种重复模块基因拼接方法。

背景技术

随着基因工程技术的发展，蛋白质生物合成已经成为一种实用的技术，提供源源不断 的原材料蛋白。蛋白材料应用由来已久，但是许多科学研究仅局限于合成相同的、随机的 多聚物(α-氨基酸)，或者对天然蛋白进行重新构建。蛋白质生物合成最主要的优点在于能 够直接产生分子量准确的一级结构确定的高分子量多肽。相对传统的聚合物合成方法，多 肽生物合成更接近完整的大分子结构，如大小、组成、序列、拓扑和立体化学。生物合成 多聚物可被视为单一的模式聚合物，并可能具有独特的结构，因此，其序列特异性的结果 可反映在材料的特性上。以天然蛋白质序列或人工合成的非天然蛋白质为基础，将重组 DNA(rDNA)技术和细菌蛋白质表达系统应用于重复多肽的生物合成。

蛋白质聚合物的生物合成需要大量合成基因的拼连，这些合成基因编码目标多肽序列 的串联重复。此过程一般涉及一个非回纹对称结构的粘性末端的双链寡核苷酸嵌合结构的 合成，这些DNA单体通过酶连接专门形成寡聚的头接尾形式，最终使得仅正义链(编码 链)被翻译成多肽。DNA串联体在连接酶的介导下与表达载体连接，并转化合适的表达宿 主(一般是大肠杆菌)。通常，目的基因被置于可诱导控制的强启动子下，例如T7噬菌体 启动子，这样目的蛋白可以在宿主中得到过量表达。

尽管上述方法已成功应用于一些多聚蛋白质聚合物的合成，但是此法还是有许多缺 点。最显著的缺点依赖于识别非回纹对称结构切割位点的限制性核酸内切酶组成的一个限 制位点库，这些核酸内切酶是形成DNA单体头尾方向自连所必需的。通常情况下，需要 在目标多肽的重复序列中引入额外的氨基酸残基，以此来制造限制性酶切位点。此外，这 些核酸内切酶能够松弛性识别序列的专一性，这就增加在表达质粒的内部位点断裂的可能 性。

目前，限制性内切酶发现已超过3000种。这些酶根据其亚基组成、酶切位置、识别 位点、辅助因子等因素可以划分为三大类：I型限制性核酸内切酶，II型限制性内切酶和 III型限制性内切酶。在基因工程中使用的是II型限制性内切酶。II型(type II)限制与修 饰系统所占的比例最大，达到93％。II型限制性内切酶相对来说最简单，它们识别回文对 称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3′-羟基和5′-磷酸基团的DNA产物， 需Mg²⁺的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需SAM。识别序列主要为4-6bp，或更长 且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异， 有些是隔开的。II型限制性内切酶中还有几类特殊的酶：II S型(typeIIs)限制与修饰系 统，占5％，与II型具有相似的辅助因子要求，但识别位点是非对称的，也是非间断的， 长度为4-7bp，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内；II G型限制酶切割位点在 识别位点两侧，最终可以使得酶切位点丢失；在II型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶 只切割双链DNA中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶(nicking enzyme)， 如N.Bst NBI。

在实际应用中，最常规使用的是II型酶，但是II S型酶因其识别位点在切割位点之外， 使其在克隆制备中有着许多独特的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种重复模块基因拼接方法，该方法对多个重复模 块基因的重复拼接，且这些模块之间没有任何的酶切位点残基保留，真正实现重复模块之 间的“无缝”连接，且此拼接具有方向性。

本发明的一种重复模块基因拼接方法，包括：

(1)利用两条PCR引物对目的基因进行扩增；

引物设计必须符合以下条件：

向5’添加重复序列：

上游引物：

5’-3～5个保护碱基+II型限制性内切酶识别位点+0～2个间隔碱基+II S型限制性内切 酶识别位点+目的基因5’端完全匹配的碱基20～30个-3’；

下游引物：

5’-3～5个保护碱基+II型限制性内切酶识别位点+0～2个间隔碱基+II S型限制性内切酶识 别位点+NNNN目的基因3’端完全匹配的碱基20～30个-3’；

其中，N为目的基因的5’端起始的4个碱基；N的个数与所选用的II S限制性内切酶的粘 性末端个数相同；