[发明专利]一种重复模块基因拼接方法

权利要求书

1.一种重复模块基因拼接方法，包括：

(1)利用两条PCR引物对目的基因进行扩增；

引物设计必须符合以下条件：

向5’添加重复序列：

上游引物：

5’-3～5个保护碱基+II型限制性内切酶识别位点+0～2个间隔碱基+II S型限制性内切 酶识别位点+目的基因5’端完全匹配的碱基20～30个-3’；

下游引物：

5’-3～5个保护碱基+II型限制性内切酶识别位点+0～2个间隔碱基+II S型限制性内切酶识 别位点+NNNN目的基因3’端完全匹配的碱基20～30个-3’；

其中，N为目的基因的5’端起始的4个碱基；N的个数与所选用的II S限制性内切酶的粘 性末端个数相同；

向3’端添加重复序列

上游引物：

5’-3～5个保护碱基+II型限制性内切酶识别位点+0～2个间隔碱基+II S型限制性内切 酶识别位点+NNNN+目的基因5’端完全匹配的碱基20～30个-3’；

下游引物：

5’-3～5个保护碱基+II型限制性内切酶识别位点+0～2个间隔碱基+II S型限制性内切 酶识别位点+目的基因3’端完全匹配的碱基20～30个-3’；

其中，N为目的基因的3’端末尾的4个碱基；N的个数与所选用的II S限制性内切酶的粘 性末端个数相同；

(2)分别利用两个II型限制性内切酶对PCR产物和质粒pET-LIC进行双酶切，PCR 产物酶切后片段与质粒载体相连接，转化感受态细胞后得到质粒pET-TS；

其中，切割PCR产物所用的两个II型限制性内切酶与扩增该产物所用引物中的两个II 型限制性内切酶相同；

(3)向5’端或3’端添加目的基因序列：利用II型和II S型限制性内切酶双酶切目的基 因PCR产物并回收酶切后片段，同时利用II型限制性内切酶和II S型限制性内切酶双酶切 质粒pET-TS并回收载体质粒片段，然后进行连接转化，得到质粒pET-TS2；

(4)向5’端或3’端添加目的基因序列：利用II型限制性内切酶和II S型限制性内切酶 双酶切目的基因PCR产物并回收酶切后片段，利用II型限制性内切酶和II S型限制性内切 酶双酶切pET-TS2并回收载体质粒片段，然后进行连接转化，得到质粒pET-TS3；

其中，步骤(3)或(4)中向5’端添加，切割PCR产物所用的II型限制性内切酶与 载体中待重复目的片段5’上游的II型酶相同，II S型限制性内切酶与载体中待重复目的 片段5’的II S型酶酶切粘性末端互补，且切割质粒所用的II型限制性内切酶与切割PCR 产物所用的II型限制性内切酶相同；向3’端添加，切割PCR产物所用的II型限制性内切 酶与载体中待重复目的片段3’下游的II型酶相同，II S型限制性内切酶与载体中待重复 目的片段3’的II S型酶酶切粘性末端互补，且切割质粒所用的II型限制性内切酶与切割 PCR产物所用的II型限制性内切酶相同；

(5)双酶切目的基因PCR产物及上一步骤连接的质粒，利用相同的方法将片段不断 的插入到质粒中，且此插入方法具有方向性，完成基因的重复拼接；

所述步骤(1)中的引物对序列为根据蛛丝鞭毛状丝696bp的目的基因所设计：

向5’添加重复序列：

上游引物：5’-ggtcatatttggggtctcggctggatccggtctcgctggtgtttctg-3’；

下游引物：5’-ggtctatgagccaaacctgcttctttccagctccgcccgggccataaatgccacc-3’；

所述步骤(1)中的引物对序列为根据蛛丝鞭毛状丝819bp的目的基因所设计：

向3’添加重复序列：

上游引物：5’-ggcggtctctggcggtggtcaacgtggtcctcgctc-3’；

下游引物：5’-ccgctcgagttaacccagagcctgagtc-3’；

所述步骤(2)、(3)或(4)中的II型和II S型限制性内切酶是按1∶1的单位比U/U混合进 行双酶切；

所述步骤(2)、(3)或(4)中的II型限制性内切酶为Nde I或Xho I，II S型限制性内切酶 为Bsa I或BspM I；

所述步骤(2)、(3)或(4)中的PCR产物酶切后片段与质粒载体是按摩尔比2∶1进行连 接；

所述步骤(3)中的向5’端添加目的基因序列：利用Nde I和BspM I双酶切目的基因PCR产 物并回收酶切后片段，同时利用Nde I和Bsa I双酶切质粒pET-TS并回收载体质粒片段， 然后进行连接转化，得到质粒pET-TS2-5’

所述步骤(3)中的向3’端添加目的基因序列：利用Xho I和Bsa I双酶切目的基因PCR产 物并回收酶切后片段，利用Xho I和BspM I酶切质粒pET-TS1-3’并回收载体质粒片段，然后 进行连接转化可以，得到质粒pET-TS2-3’；

所述步骤(4)中的向5’端添加目的基因序列：利用Nde I和BspM I双酶切目的基因PCR产 物并回收酶切后片段，利用Nde I和Bsa I双酶切pET-TS2并回收大片段并回收质粒片段， 然后进行连接转化，得到质粒pET-TS3-5’；

所述步骤(4)中的向3’端添加目的基因序列：利用Xho I和Bsa I双酶切目的基因PCR产 物并回收酶切后片段，利用Xho I和BspM I酶切质粒pET-TS2-3’并回收载体质粒片段，然后 进行连接转化可以，得到质粒pET-TS3-3’。