[发明专利]以Alu间聚合酶链式反应为基础的检测基因区特征的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地来说，是涉及集中检测基因区单核苷酸多态性(SNP)、点突变，序列插入/缺失及双脱氧核苷酸分子(DNA)甲基化CpG位点的方法。该方法以Alu家族，特别是AluY亚家族共同序列为主要寡核苷酸引物，利用多个引物Alu间聚合酶链式反应(inter-Alu PCR)扩增基因组DNA，单次扩增DNA复制子多集中于基因组中各基因区。该方法的特征在于，通过inter-Alu PCR可过滤掉部分非基因区序列，使新一代测序技术集中检测基因组中基因区的SNP、点突变，序列插入/缺失及DNA甲基化CpG位点，并可节省测序所需基因组DNA用量。

背景技术

以新一代测序技术循环阵列合成测序法为基础设计的高通量测序仪，可以在单次测序中产生百万个碱基的序列。这一生物技术的进步，极大程度上减少了全基因组测序的费用，并且大大加快了疾病病因学研究的速度。该技术现用于包括肿瘤，精神疾病在内的多种疾病的相关性研究中。然而在单次测序中，需要至少3μg基因组DNA，并且3μg通常不能满足全基因组测序的要求。高DNA总量的需求会降低样本提供者的认同度。此外，由于高通量测序仪随机测序的特点，单次测序所得的数据可能只集中于基因组中的某些区域，而丢失掉研究所需要的其它重要区域。依据人类基因组计划所提供的数据，基因组中只有1％的区域为基因编码区，而整个基因区只占基因组的25％。也就是说，高通量测序仪测序所产生的数据中，只有少数涵盖对于疾病病因学研究比较重要的基因区序列。因此，当前的方法仍存在成本-质量-数量不均衡的问题。

新方法需减少测序所需DNA用量，增加数据有效性，同时进一步降低成本。聚合酶链式反应(PCR)因其可呈指数级扩增模板DNA，所以可以降低模板DNA用量。然而，单一基因区扩增所使用的PCR技术会局限所获得信息的数量，多对引物的多次PCR反应也会造成工作量成倍增加。美国专利5,773,649、6,060,243及7,537,889均涉及到可以利用Alu间聚合酶链式反应(inter-Alu PCR)扩增人类基因组DNA中多个区域。其中，专利5,773,649是利用inter-Alu PCR技术扩增肿瘤基因组DNA及同一患者外周血DNA，并通过DNA琼脂糖凝胶电泳观察肿瘤基因组DNA复制错误(replication error)表型。但是，具体在该疾病中基因组中哪些区域发生了突变并没有进行深入研究。

研究表明，多种遗传疾病与AluY亚家族插入基因组中造成基因组不稳定有关；同时，该亚家族作为重组热点区，其结构内部及周围区域的SNP可能为疾病相关SNP。另外，在整个人类基因组，Alu家族可包含多达33％的CpG位点。且既往研究表明，在肿瘤基因组中，Alu序列中的某些特殊CpG位点的甲基化水平出现显著性降低，这一现象在AluY亚家族中尤为突出。因此，以AluY共同序列为寡核苷酸引物的inter-Alu PCR，可以实现集中于基因区SNP、点突变，插入/缺失及DNA CpG位点甲基化水平的检测。这一改进的方法可以满足在疾病病因学研究中使用微量DNA就可以通过高通量测序仪器获得更多有效的测序数据，满足研究对成本-质量-数量均衡的要求。

发明内容

本发明涉及集中检测基因区单核苷酸多态性(SNP)、点突变，插入/缺失及双脱氧核苷酸分子(DNA)甲基化CpG位点的方法。总体上说，该方法是通过inter-Alu PCR，使新一代测序技术可集中检测基因组中基因区序列特征的方法。

依据Alu重复序列集中于基因区这一特点，通过多引物inter-Alu PCR扩增基因组中多个两Alu序列间区域，所得纯化PCR产物的质量为模板基因组DNA质量的6倍；并且，该PCR产物为涵盖基因组中多个基因区域的DNA复制子。此方法可保证新一代测序技术仅使用纳克级基因组DNA，便可以集中检测基因区的SNP、点突变，序列插入/缺失及DNA甲基化CpG位点。