[发明专利]一种基于PCR的低成本、简单、高效的SNP检测方法

说明书

专利领域

本发明属于生物技术，涉及遗传学检测领域。

技术背景

近年来，随着大规模DNA(脱氧核糖核酸)测序技术的迅速发展，科学家已经能够广泛了解重要的DNA区域的编码，并研究不同人的个体之间的DNA差异；遗传学家利用这些手段和数据做了大量研究，成功地找到了许多人的遗传多样性与疾病或其他性状的联系。科学家研究最多的遗传标记是单核苷酸多态性(SNP)，即同一物种的不同个体在基因组DNA某一单核苷酸位点上的差异。SNP有广泛的用途。SNP对疾病产生的机制有影响，也对个体对药物，病原体，疫苗的反应有影响。类似的，SNP在别的生物学领域，比如对于庄稼和牲畜的培育都有重要作用。

由于SNP在科学研究和应用上的价值，已经涌现出多种SNP分型(检测)的技术(参考资料1)。下面对主要的技术进行分类介绍。

1.测序。最常见的方式是对包括该SNP的周边区域的DNA进行测序。这种方法较为直接可靠，被很多遗传学科研实验室采用。其缺点是需要昂贵的测序设备，费用高，通量低速度慢。

2.限制性内切酶长度多样性(RFLP)。这是最早最简单的一种检测方法。限制性内切酶有很多种，每种都能以很高的亲合力与特异的DNA限制性位点结合并切断DNA。在使用多种限制性内切酶对基因组DNA进行消化后，再用凝胶电泳检测片断大小，就有可能知道内切酶是否切断了一个预期的限制性位点。如果没有切断，则胶电泳检测不到那个预期大小的片断，则表明该位点(SNP)有不同的核苷酸。然而，由于真核生物基因组的复杂性及这种方法针对不同位点需要特定内切酶的特性，该方法一个反应往往只能做一个位点，无法增加通量。

3.PCR方法。针对SNP的不同的等位基因设计不同引物对该位点进行PCR扩增。这些引物与SNP周边的序列配对，但每种只与SNP上的一个等位基因配对。每种不同的引物只扩增出与之对应的SNP等位基因型。两种引物得到的产物片段大小有一定的差异，因此可以通过检测区分。PCR方法简单，设备需要小，较为经济，但设计出特异性好又能高效多重化的引物则有较大难度，并且实验经常需要摸索条件，因而也不容易做高通量的检测。

4.翻转内切酶法(Flap-endonuclease，或FEN)。两个不同的寡聚核苷酸探针与一个SNP相结合，形成一定的结构，然后一种内切酶识别这个结构并将DNA切断。其中，第一个探针与SNP的3’端DNA结合，第二个探针与特定的SNP等位基因结合。通过使用不同的第二探针，就可以检测不同的SNP等位基因型。这里，DNA切割可以用荧光共震能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer，或FRET)系统来探测。该方法的灵敏度和特异性都较好，但目前也只能一次做单个SNP的检测。

5.引物延伸法。这种方法有两个步骤。首先，特异的探针与SNP位点的直接上游结合。然后，DNA多聚酶将探针的DNA延伸，使之含有该SNP的核苷酸。SNP的不同等位基因可以通过荧光标记检测。一种常用的方法是在反应中加入带有不同荧光标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)，在引物与SNP上游结合后让其延伸单个碱基，然后通过检测加上的不同ddNTP的荧光，就可以知道这个SNP的等位基因是哪个。Sequenom′s iPLEX系统采用了这种方法，并用质谱仪来检测。该方法适合用来检测中等数目(小于40)的SNP，但需要较昂贵的专门仪器。Illumina的Infinium系统也是基于这类方法，但它使用了抗体检测。该方法可以做超过10000个SNP的检测，适合全基因组扫描，但是价格较贵。APEX-2方法则将引物延伸法与基因芯片技术结合起来，也能达到高通量。

6.5’-核酸酶法。TaqMan检测法利用了Taq DNA多聚酶的5’核酸酶活性。这种方法用5’和3’端的PCR引物来扩增含SNP的区域，再用FRET系统结合两个特异的DNA探针来区分不同的等位基因。这些探针在5’端有荧光基团，3’端有熄灭基团，因此在探针完整时不产生荧光。在PCR过程中，如果该探针序列与SNP特异配对，则可以与目标DNA完美结合，然后Taq酶在进行DNA扩增时就可以将探针的5’端降解，荧光基团就游离出来并发光。如果该探针序列与SNP不特异配对，则与目标DNA不能完美结合，5’核酸酶活性就无法使探针的5’端降解。TaqMan法可以用来检测最多7个SNP。如果在一块板上同时进行多个反应，可以达到很高的通量。