[发明专利]一种基于PCR的低成本、简单、高效的SNP检测方法

权利要求书

1.一种基于PCR的用于检测SNP的方法，其特征在于，a)每个SNP的每个等位基因都有一个特异的引物和相对应的长度唯一的PCR产物；b)针对检测中采用的DNA检测手段的特性，寻找一种优化的PCR产物长度分配方案，以增大检测SNP的数目；c)根据设计的PCR产物长度分配方案及待测SNP，按一定算法，逐个地设计和优化所有SNP的PCR引物。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，每个SNP有两对特异引物，引物1(中心引物)的3’端与DNA的A链的SNP的一个等位基因x配对，引物2(侧端引物)与A链下游的序列配对；引物3(中心引物)的3’端与DNA的B链的SNP的另一个等位基因y配对，引物4(侧端引物)与B链下游的序列配对；引物1和2可以从带有等位基因x的DNA扩增出长度为a的片段，引物3和4可以从带有等位基因y的DNA扩增出长度为b的片段，a不等于b。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，利用一种算法找到可以检测尽量多SNP的PCR产物长度分配方案，其步骤如下：

根据可检测的DNA长度范围(O，L)和分辨率(S)，算出可以检测的DNA的不同长度的数目为N＝L/S；

将这算法的目的抽象为：对一个数列(1，2，…，N-1，N)，每个SNP从此数列中抽取三个不同的数a、b、c，使a+b＝c，要找到一个抽取数字的方式，使得尽可能多的SNP能抽到数；

循环进行以下两个取数步骤，直到取不到合适的数为止：1)从以上数列的两端取出3个还未被取走的数a、b、c，使a+b＝c，赋给下一个SNP，2)从数列的中间点两侧取出3个还未被取走数a、b、c，使a+b＝c，赋给再下一个SNP；

根据每个SNP取到的3个数a、b、c和分辨率(S)，可得出该SNP的3个产物长度，即a×S、b×S、c×S。

4.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，在逐个为每个SNP设计引物时，将新设计的引物序列与已经设计好的引物序列进行一一比较，看看引物之间是否会形成交叉二聚体；如果该SNP的侧端引物与别的引物形成二聚体，则将该SNP的侧端引物的位置做变动，来消除这些二聚体；如果是该SNP的中心引物与另一个SNP的侧端引物形成二聚体，则将另外那个SNP移至待设计的SNP列表的最后，以待重新设计引物。

5.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，在逐个为每个SNP设计引物时，每次将新设计的引物序列与前面已经设计的引物序列一一配对，再使用穷尽的序列比较方法(可以是，但不限于TAGSCAN)与基因组进行比较，看是否有长度小于最大检测长度的非特异性扩增；如果该SNP的侧端引物与别的引物配对导致非特异性扩增，则将该SNP的侧端引物的位置做变动，来消除这些非特异性扩增；如果是该SNP的中心引物与另一个引物SNP的侧端引物配对产生非特异扩增，则将另外那个SNP移至待设计的SNP列表的最后，以待重新设计引物；如果该SNP的中心引物与别的SNP的中心引物配对产生非特异性扩增，则可将该SNP中心引物的长度做调整，以试图消除非特异性扩增；如果无法通过调整引物来消除非特异性扩增，则可增加引物长度和退火温度，重新设计所有引物。

6.由以上方法得出的PCR引物和实验方案，其特征是，每个SNP的每个等位基因对应一个唯一的PCR产物长度，PCR产物长度分配充分利用了检测的空间，引物和实验设计排除了非特异性扩增；利用所设计引物和实验方案进行单个PCR反应，再用实验方案中指明的手段检测产物长度，就可确定所有SNP的基因型。