[发明专利]一种用磁珠分离基因组DNA试剂盒及其应用

说明书

技术领域

一种应用磁珠从样品中提取基因组DNA的试剂盒，属于生物技术领域，涉及试剂盒的组成及其应用。

背景技术

生命是由基因组决定的。绝大部分基因组，包括所有的细胞生命形式的基因组，都是由DNA组成。因此为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提，DNA的提取也就成为分子生物学实验技术最重要、最基本的操作之一。

在真核生物中，95％的基因组DNA存在于细胞核中，5％分布在线粒体和叶绿体等细胞器中。植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白(即染色质或染色体)的形式存在于细胞核内。DNA提取的方法通常要满足以下几个条件：1)保证DNA结构的完整性；2)纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质；3)排除有机溶剂和金属离子的污染；4)蛋白质、多糖、脂类等杂质的含量降到最低程度；5)排除RNA分子的污染；6)提取方法要简便、省时、费用低，尽可能的避免使用危险的化学试剂。基因组DNA提取主要分为三大步，第一是细胞裂解，使细胞质膜和核膜破碎，让基因组DNA和其它核酸分子及其它生物大分子尤其是蛋白质解离而游离出来；第二步是去除与DNA结合的蛋白质、多糖及脂类等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子；第三步是基因组DNA的富集，将游离在液相中的核酸选择性分配、沉淀或吸附纯化。

目前用于细胞裂解的方式主要有机械作用、化学作用和酶作用。1)机械作用：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适于高分子量长链核酸的分离。2)化学作用：在一定的pH环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、TritonX2100、Tween 20、NP240、CTAB、sar2cosyl、Chelex2100等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)而获得。目前基因组DNA提取试剂盒主要用CTAB法、SDS法和异硫氰酸胍裂解。3)酶作用：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)以使细胞破裂，核酸释放。

基因组DNA的分离与纯化的常规方法主要有：1)酚抽提/沉淀法：将细胞裂解后，多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的，加入RNA酶除去核酸中的RNA，然后加入异丙醇或乙醇等沉淀DNA，用70％乙醇漂洗沉淀，除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子，最后用TE溶解DNA备用。2)密度梯度离心法：双链DNA、单链DNA、RNA与蛋白质具有不同的密度，因而可以通过密度离心形成不同密度的纯样品区带，该方法适用大量核酸样本的制备。3)层析法：层析法是利用不同物质一些理化性质的差异而建立起来的分离分析方法，包括吸附层析、亲和层析、离子交换层析等方法。在一定的条件下，核酸可以被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃表面而与其它生物分子分离，结合到固相载体的核酸可以用低盐缓冲液或水洗脱下来。

磁珠是指那些直径在几十纳米到数微米，在磁场下表现出磁性，由无机/有机或无机/无机材料组成的外形多呈现为球状的复合粒子，用于生物分离的磁珠表面修饰活性功能基团。

磁珠法提取基因组DNA是近几年才发展起来的核酸提取方法。其提取方法不需要苯酚和氯仿等毒性大的有机溶剂，提取的基因组DNA纯度高、产量高。提取步骤简单省时，不需要离心，不仅可以满足从小量到大量不同提取规模的要求，还能够选择手动或者自动化操作，使分离技术取得了巨大的进步。

在磁珠合成过程中，通过共聚合和表面修饰等引入活性基团，这些活性基团有-COOH，-NH₂，-OH，-COH，-SH，-SO₃等，利用磁珠表面的这些功能基团和具有生物活性分子，如单克隆抗体，链霉亲和素，凝集素、酶以及寡聚核苷酸等，以共价键的形式偶联在磁珠的表面，制备成带有磁性的亲和吸附剂。然后将这些具有磁性的亲和吸附剂与生物样品共同孵育后，目标分子能够迅速被磁珠捕获，可以在磁场作用下从液相中沉降下来，经过简单的洗涤，从而分离得到表面结合有目标分子的磁珠复合物，通过改变洗涤条件可以将目标分子从磁珠上洗脱下来。