[发明专利]利用HRM技术在非细胞体系中进行基因突变检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及肿瘤诊断中间信息相关的基因的快速检测，以及对需求的检测样本的替代，通过检测非细胞体系的微量DNA实现基因的快速检测。

背景技术

高分辨熔解曲线分析技术(high-resolution melting analysis，HRM)是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。HRM技术对DNA样本的质量要求很高，所以常用于研究细胞体系的研究。

HRM技术应用于基因突变检测依据于饱和性荧光染料的，根据荧光信号强度的微妙变化来判断基因类别，故HRM技术有着很高的灵敏度和准确度。

基因指导下个体化疗与个体化分子靶向治疗是近年兴起的一种肿瘤药物治疗选择方式，目的是提高肿瘤药物治疗的精确性，减少预期无效的治疗。美国食品和药品管理局(FDA)明确支持应用靶向药物前进行如EGFR、K-ras、B-raf等基因突变检测，以决定对应药物是否有效，而先前欧洲药品管理局(EMEA)已经宣布了这个决定。作为世界上最权威和最严格的药品审批机构，FDA这个决定无疑标志着“个性化治疗的时代”的来临。

靶向治疗药物与基因信息相关性如下：

(1)《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：通常如EGFR 19外显子和21外显子突变或缺失的患者对这些药物治疗有效，无突变者预后不良。《09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当K-ras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯(Tarceva/Erlotinib)进行分子靶向治疗。

NSCLC患者使用易瑞沙或特罗凯时，应同时检测EGFR和K-ras突变。

(2)K-ras是公认的癌基因，参与表皮生长因子受体(EGFR)信号传导过程，与EGFR抑制剂类靶向药物的疗效密切相关。《美国国立癌症综合网络(NCCN)结直肠癌临床实践指南》明确指出：一是所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态；二是只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂如西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)的治疗。

(3)B-raf基因的突变检测可协助医生筛选西妥昔单抗(Cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)等药物治疗的有效人群。建议B-raf野生型患者接受该类EGFR抑制剂的治疗。

(4)其他相关基因等。

为了提高肿瘤药物治疗的精准性，相关基因的检测成为了用药前的必检项目，以减少预期无效的治疗。由于以往技术的局限，对DNA序列信息的检测也存在一定的局限性，所以对检测的样本需求也是存在一定的局限性。由于基因突变的比例在人体整个机体中是微量的，只有在肿瘤组织中的突变比例较高，所以以往的样本需求肿瘤组织样本进行基因的突变检测，而对于血浆，血清等非细胞体系中的游离DNA的检测是无法完成的。

目前普遍应用的基因突变检测方法为限制小片段长度多态性分析法(RFLP法)和DNA直接测序法。RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法。但是该方法存在以下缺点：RFLP实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，以及存在第一轮酶切不完全导致的假阳性