[发明专利]利用HRM技术在非细胞体系中进行基因突变检测的方法

权利要求书

1.一种利用HRM技术在非细胞体系中进行基因突变检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)设计并选取含有目的基因的靶向区域中至少15个连续的核苷酸构成连续核苷酸序列的若干个引物对；

(2)从非细胞体系中提取DNA，利用若干个预先筛选的引物对对目的基因靶向序列进行特异性扩增；

(3)根据高分辨率熔解曲线法对扩增后的基因序列进行突变位点检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述非细胞体系选自外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因选自EGFR、KRAS、BRAF、C-KIT、P13K和PDGFRA。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述特异性扩增在PCR反应体系中进行，所述PCR反应成分包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料、MgCl₂、TaqDNA聚合酶、模板DNA和水，所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液            终浓度1～10×；

dNTPs                0.1～1mM；

引物序列             终浓度为0.1～1μM；

模板DNA              0.05～2ng/μL；

TaqDNA聚合酶         0.01～0.10U/μL；

MgCl₂                终浓度为1～5mM；

荧光染料             1～3×。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述PCR反应体系终浓度组成为：

PCR缓冲液            终浓度1～5×；

dNTPs                0.1～0.5mM；

引物序列             终浓度为0.1～0.5μM；

模板DNA              0.05～1.5ng/μL；

TaqDNA聚合酶           0.01～0.10U/μL；

MgCl₂                  终浓度为1～3mM；

荧光染料               1～2×。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述荧光染料选自DNA饱和性染料包括EvaGreen染料、LCPLUS染料、ResoLight染料、SYTO 9染料；所述dNTP混合液包括10mM dATP、10mM dCTP、10mMdTTP、10mM dGTP的混合液；所述PCR缓冲液包括Tris·cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁；-20℃下pH值在8.0-9.0间。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于进行PCR扩增反应的条件为92～97℃预变性4～15min；92～97℃变性10～30s，50～65℃退火10～30s，70～75℃延伸10～30s，35-55个循环。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述高分辨率熔解曲线法的条件为：92～97℃变性1分钟；40℃复性1分钟；然后初始熔解温度60～65℃开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，30～50次每秒。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中为集成程序化方法，进行PCR扩增反应的条件为95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火15s，72℃延伸25s，50个循环；所述高分辨率熔解曲线法的条件为：95℃变性1分钟；40℃复性1分钟；然后初始熔解温度65℃开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，40次每秒。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述从非细胞体系中提取DNA选自使用QIAGEN Blood Mini kitt试剂盒或TIANGEN Blood Mini kit试剂盒提取或使用传统酚氯仿法提取。