[发明专利]哺乳动物肝细胞体外组织化培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用一种新型的特异性培养基质进行肝细胞体外组织化培养。

背景技术

肝脏是人体的重要器官，肝脏的病变，如：肝硬化、肝衰竭等会危及患者的生命。临床上对肝脏病变晚期的患者实施肝脏移植手术来延缓患者的生命。由于肝脏供体来源的问题，很多肝病晚期患者因为等不到供体，而终止生命。即便得到供体，接受肝移植的患者，也要在随后的生活中承担着终身药物免疫抑制的经济负担。随着组织工程学的发展，新的治疗手段为患者提供了改善和复活肝功能的可行性。

组织工程学是融合了工程学和生命科学的基本原理、基本理论、基本技术和基本方法，在体外构建一个有生物活性的种植体，植入体内修复组织缺损，替代器官功能；或作为一种体外装置，暂时替代器官功能，达到提高生存质量，延长生命活动的目的。组织工程学是一个跨学科的领域，其将工程和材料科学与医学结合在一起。目标在于恢复受损组织或改善其功能。其原理是：从人或动物体中取出部分组织，体外提取细胞，并进行体外培养与增殖。然后将其再次移植到体内。与传统的供(受)体移植不同，传统的移植需要供体，而且移植后需要终身药物免疫抑制。而本方法则提供了能够使用内源(自体)细胞的极其重要优点。

组织工程学技术的应用，其关键就是细胞体外的培养与增殖，这对移植到体内的细胞是否发挥功能，是极其重要的。目前细胞体外培养方法越来越多，也越来越先进，但存在的问题是，原生肝细胞在体外培养过程中，一定时间内较难培养出相当数量的细胞，从而移植回体内达不到肝细胞的功能。

CN1587392A在聚砜中空纤维丝内进行肝细胞的培养，由于促进肝细胞球状体的形成需较长时间，而球状体形成的推迟会使肝细胞较快失去分化表型和发生死亡；而CN101624473A在由丝素蛋白和半乳糖基化壳聚糖制备得到的载体中进行肝细胞的培养，此方法如需进行肝细胞的大规模培养，还需优化微载体制备反应条件。并且上述方法获得的肝细胞可作用于体外生物反应器，不便于移植到体内形成组织化。为获得一定数量的肝细胞，使其移植回体达到肝细胞的功能并能组织化，原生肝细胞的体外培养方法的条件控制非常重要，尤其细胞培养基质的三维结构和形状大小非常关键。

发明内容

本发明提供一种能使肝细胞在体外快速、高效的培养基质，基质的三维结构具有更大的体表面积比，有利于肝细胞在基质上的粘附，利于肝细胞间的信息传递以及营养、氧气和代谢物之间的流通，从而提高体外肝细胞培养质量和数量，使移植回体内的肝细胞达到相应的功能；并且培养基质的形状、大小有利于移植回体内。

一种哺乳动物肝细胞的体外培养方法，其关键是使用经静电纺织成的具有三维多孔结构的培养基质。

其中，培养基质由胶原蛋白或丝素蛋白，与聚乳酸(PLA)按质量百分比配置成混合物，利用静电纺织技术制备。

其中，聚乳酸的分子量为10000-150000道尔顿。

其中，胶原蛋白20-40％或丝素蛋白20-40％，聚乳酸为60-80％的混合物溶于二氯甲烷，制成质量浓度为6-8％的电纺液；

其中，将电纺液加入静电纺织装置中，静电纺织制成直径1-2cm，高度3-4mm的扁圆柱形基质；

其中，将静电纺织获得的基质用真空干燥方法去除残留的二氯甲烷；

其中，基质体积93-96％为微孔，4-7％为基材；

其中，基质上具有不同大小的孔，孔直径为80μm-500μm之间；

其中，优选基质具有如下的孔径分布，基质上大约4％的孔平均直径在80-110μm；大约6％的孔平均直径在111-120μm；大约7％的孔平均直径在121-130μm；大约5％的孔平均直径在131-260μm；大约5％的孔平均直径在261-300μm；大约15％的孔平均直径在301-340μm；大约6％的孔平均直径在341-360μm；大约10％的孔平均直径在361-390μm；大约10％的孔平均直径在391-430μm；大约5％的孔平均直径在431-460μm；大约15％的孔平均直径在461-480μm；大约10％的孔平均直径在481-500μm。合适的孔径大小与分布能提高细胞的培养效率和质量。

其中，基质上孔间相互连通；

其中，基质的消毒用γ射线照射；

其中，所述哺乳动物是人或大鼠。

本发明的有益效果：

本发明的方法中使用的微孔结构的基质，其结构利于细胞吸附，有利于细胞间的相互接触以及氧气、营养物质的传递，使肝细胞在体外高密度培养，并保持细胞生物学活性及其功能，另外，基质的特殊结构，植入体内后，有利于血管的在基质中攀爬生长、组织化。

具体实施方式