[发明专利]特异性结合EPO的DNA适配体、其制备方法及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质学、分子生物学以及组合化学领域。具体而言，本发明涉及蛋白新型识别元件-DNA适配体(Aptamer)、其制备方法及其用途。

背景技术

促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是一种促进人体红细胞生成的功能性糖蛋白。当人体处于低血氧浓度时，肾脏分泌产生的促红细胞生成素通过激活红祖细胞膜上的促红细胞生成素受体，使之增殖分化成成熟的红细胞，从而调节外周红细胞的数量，因此EPO是一种强有力的红细胞生成刺激剂(Jelkmann W.Erythropoietin：structure，control of production，and function.Physiol Rev，1992，72(2)：449-489)。

1985年，人们利用基因重组技术合成生成了重组人促红细胞生成素(rHuEPO)。目前商品化的rhuEPO主要有四种，rHuEPO-α，rHuEPO-β，新型红细胞生成刺激蛋白Darbepoetin(商品名Aranesp)和持续性的促红细胞生成素受体激动剂(Continuous ErythropoietinReceptor Activator，CERA)。rHuEPO在临床上主要用于治疗肾性贫血以及肿瘤等各种慢性疾患所伴发的贫血。同时，由于EPO具有可促进红细胞产生，从而增加机体的携氧能力，改善耐受力的特性，因此在人类体育竞技和马术比赛中经常被滥用作兴奋剂以提高比赛成绩。据估计在耐力比赛中，约有3-7％的运动员使用重组EPO(Wilber RL，Detection of DNA-recombinant human epoetin-alpha as apharmacological ergogenic aid.Sports Med，2002，32：125-142.)。在2009年的禁用药物清单中，S2项下的第一项以促红细胞生成刺激剂代替促红细胞生成素，以便更清晰的标明近年出现的各类新的EPO类似物(The World Anti-Doping Code-THE 2009 PROHIBITED LISTINTERNATIONAL STANDARD.http://www.wada-ama.org)。因此如何对EPO进行有效的检测是当前人们关注的热点。

在临床检测中，近年发展起来的免疫测定法是目前应用最广泛的EPO检测方法。免疫测定法以抗原、抗体反应的特异性和亲和性为基础，主要包括放射免疫法、酶免分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法等。

在EPO作为兴奋剂的检测方面，2000年以来，国际奥委会使用等电聚焦-免疫双印迹法检测运动员是否注射过重组EPO产品，并将该方法作为人类体育比赛中滥用EPO的标准检测方法，其每条印迹谱带的检出灵敏度为1.7pg。另外，MALDI-TOF-MS和ESI-MS等各类质谱技术也为rHuEPO的检出提供了灵敏的方法(Guan F et al，Differentiation andIdentification of Recombinant Human Erythropoietin andDarbepoetin Alfa in Equine

综上所述，无论是在EPO的临床检测还是作为兴奋剂的检测中，都是基于免疫抗体捕获富集的技术。但抗体自身对于环境温度和pH变化的敏感性与不耐受性以及产品批间重复性较低等这些局限性均影响免疫分析的稳定性并且阻碍其灵敏度的进一步提高。且有报道称用于制备EPO单克隆抗体AE 7A5的抗原氨基酸序列中含有的中心四肽在500多种人体蛋白和185种大肠杆菌蛋白中广泛存在，因此导致抗体AE7A5会与真核生物、菌类蛋白和哺乳动物组织，例如膀胱上皮组织产生明显的交叉反应(Franke W W等，errors and risks of false-positiveresults in urinary EPO drug tests.Clinica Chimica Acta.2006，373：189-190.)。因此，亟需高稳定性、高灵敏度、低交叉反应且方便、快捷的EPO检测元件和检测方法的开发。