[发明专利]特异性结合EPO的DNA适配体、其制备方法及其用途

权利要求书

1.特异性结合EPO蛋白的适配体，其选自SEQ ID NO：1～120所示的序列中的一个或者多个。

2.根据权利要求1所述的适配体，其选自SEQ ID NO：53、56、60、113、116和120所示的序列。

3.根据权利要求1-2所述的任一项适配体，其被能够增强其半衰期、提高其稳定性、防止核酸内切酶或者外切酶切割的化合物所修饰。

4.用于EPO蛋白检测的组合物、试剂盒和芯片，其中含有权利要求1-3中任一项的适配体。

5.根据权利要求4所述的适配体，其中的EPO蛋白选自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白、rHuEPO-β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一种或多种。

6.权利要求1-3中任一项的适配体用于EPO蛋白检测的用途。

7.根据权利要求6所述的适配体，其中的EPO蛋白选自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白、rHuEPO-β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一种或多种。

8.筛选特异性结合EPO蛋白的适配体的方法，包括步骤(a)-(1)：

(a)提供下述(i)-(iv)：

(i)筛选文库：ssDNA文库；

(ii)靶蛋白：EPO蛋白，其中的EPO蛋白选自天然EPO蛋白、rHUEPO-α蛋白、rHUEPO-β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一种或多种，优选rHUEPO-α蛋白；

(iii)亲和树脂：偶联有对EPO有特异性亲和力的物质的树脂，优选偶联有麦胚凝集素的琼脂糖树脂；和

(iv)偶联有EPO的亲和树脂(iii)；

(b)使步骤(a)中的筛选文库和亲和树脂(iii)在适宜的条件下接触，

所述接触可以包括温育、洗涤，

所述“适宜的条件”是指足以使筛选文库中的成员能够和亲和树脂特异性结合的结合的条件，该条件可以涉及温度、作用时间、结合缓冲液的成分、pH值；

然后收集未与亲和树脂(iii)结合的ssDNA文库；

(c)使步骤(b)中未与亲和树脂(iii)结合的ssDNA文库和亲和树脂(iv)在适宜的条件下接触，

所述接触可以包括温育、洗涤，

所述“适宜的条件”是指足以使筛选文库中的成员能够和亲和树脂特异性结合的结合的条件，该条件可以涉及温度、作用时间、结合缓冲液的成分、pH值；

(d)收集经步骤(c)处理的与亲和树脂(iv)结合的文库成员；

(e)任选地对步骤(d)的文库成员进行扩增处理；

(f)将步骤(d)或者(e)中的文库成员与步骤(a)中的(iv)在适宜的条件下接触，所述“适宜的条件”是指足以使步骤(d)或者(e)中的文库成员能够和EPO特异性结合的条件；

(g)任选地，在步骤(f)中进行条件严格化处理，所述处理选自减少靶蛋白EPO的用量、在接触步骤后增加洗涤步骤和在接触步骤中加入非竞争性抑制剂tRNA中的一种或者多种；

(h)收集在步骤(f)或(g)中与(iv)特异性结合的文库成员；

(j)重复步骤(e)-(h)，重复次数为1、2、3、4、5、6、7、8次，优选重复6-8次，更优选重复8次；

(k)对(g)步骤获得的文库成员进行确认，优选序列测定；和

(l)任选地，对获得的文库成员进行功能检测，优选电泳迁移率变动分析(EMSA)。

9.根据权利要求7所述的筛选方法，其中适宜的条件是指温育温度为37℃，作用时间为1h，筛选液的1×储液配方为：20mM Tris-HCl、140mM NaCl、5mM MgCl₂、5mM KCl，其中Mg²⁺的工作浓度保持在0.1-50mM，优选Mg²⁺的工作浓度为0.1、5、10、20、50mM，最优选5mM。

10.根据权利要求1和8所述的适配体，其中的EPO蛋白选自天然EPO蛋白、rHuEPO-α蛋白、rHuEPO-β蛋白和去糖基化的上述EPO蛋白中的一种或多种。