[发明专利]一种制备App菌影的方法及App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说，是一种利用E.coli-App穿梭载体pMC-Express和双基因裂解制备App菌影的方法及利用App菌影装载巴氏杆菌抗原OmpH外膜蛋白制备亚单位疫苗的方法。 

背景技术

胸膜肺炎放线杆菌(App)和多杀性巴氏杆菌是猪呼吸道常见的重要致病菌，引起的临床症状很难区分，常呈混合感染。大量流行病学调查资料显示，由于抗菌药物的大量使用，导致胸膜肺炎放线杆菌和巴氏杆菌细菌耐药性普遍存在，特别是高耐药菌株的出现，致使多数药物对耐药菌的临床疗效降低或无效。目前常用的猪传染性胸膜肺炎疫苗有灭活苗、弱毒苗和亚单位疫苗；猪肺疫疫苗有灭活苗及弱毒苗。各类疫苗均存在优缺点：灭活苗成本低、安全、方便，但交叉保护能力差；弱毒苗交叉保护及免疫效果好，但有返毒危险；亚单位疫苗安全，制备方便，却需与适当佐剂配合，才能发挥最佳效果，且交叉保护能力不如弱毒苗，加之灭活过程造成抗原表位的缺失或抗原性减弱，免疫效果不确定且副作用较大等缺点。因此，开展新型疫苗的研究变得尤为必要和紧迫。 

目前，利用菌影技术制备疫苗已在多国进行，但尚处于研发阶段，还未有产品推向市场。菌影技术被用于多种革兰氏阴性菌疫苗制备试验，效果良好，但存在裂解不完全的问题。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，通过引入金黄色葡萄球菌核酸酶A基因(SN)，使其与裂解蛋白E串联表达，提高裂解效率，制备APP菌影。将多杀性巴氏杆菌保护性抗原OmpH外膜蛋白导入APP菌影，以菌影为载体，发挥靶 向作用，从而实现并达到二联疫苗的免疫效果。 

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种利用E.coli-App穿梭载体pMC-Expres s和双基因裂解制备App菌影的方法，包括以下步骤： 

1)通过PCR扩增噬菌体PhiX174裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SN编码序列，通过柔性氨基酸linker串联上述双基因得到E-15aalinker-SN，将E-15aa linker-SN与含有λpL/pR-cI857温控启动子的表达载体pBV220构建温控重组表达载体pBV-E-15aa linker-SN； 

2)利用引物扩增温控双基因裂解盒插入到E.coli-App穿梭载体pMC-Express中，构建重组穿梭表达载体； 

3)采用电转化法将重组穿梭表达质粒导入App菌体，通过升温诱导制备App菌影，菌影冻干保存。 

具体包括步骤如下： 

1)E、SN和E-15aa linker-SN基因的扩增 

根据噬菌体PhiX174裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SN编码序列设计引物： 

E1：5’-CAG GAATTC ATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3’(EcoRI) 

E2：5’-GGC GTCGAC TTACTCCTTCCGCACGTAAT-3’(SalI) 

SN1：5’-CAG GAATTC GCAACTTCAACTAAAAAT-3’(EcoRI) 

SN2：5’-GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG-3’(SalI) 

再设计含15个柔性氨基酸linker的引物，用于将裂解基因E和核酸酶A基因SN串联： 

E2’：5’-TGC AGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCTCCTTCCGCAC-3’ 

SN1’：5’-GAG GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCAACTTCAACT-3’ 

以噬菌体PhiX174双链DNA为模板，分别采用E1、E2和E1、E2’为上、下引物，扩增裂解基因E，得到两组产物，后者在E基因后带有linker；以 金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923基因组DNA为模板，分别以SN1、SN2和SN1’、SN2为上、下游引物，扩增基因SN，得到两组产物，后者于SN基因前带有linker；以带有linker的E和SN基因为模板，以E1和SN2为引物，通过降落PCR法，得到双基因串联产物E-15aa linker-SN； 

2)重组表达质粒及双基因裂解体系的构建