[发明专利]一种制备App菌影的方法及App菌影装载巴氏杆菌抗原制备亚单位疫苗的方法

权利要求书

1.一种利用E.coli-App穿梭载体pMC-Express和双基因裂解制备App菌影的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)通过PCR扩增噬菌体PhiX174裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SN编码序列，通过柔性氨基酸linker串联上述双基因得到E-15aalinker-SN，将E-15aa linker-SN与含有λpL/pR-cI857温控启动子的表达载体pBV220构建温控重组表达载体pBV-E-15aa linker-SN；

2)利用引物扩增温控双基因裂解盒插入到E.coli-App穿梭载体pMC-Express中，构建重组穿梭表达载体EAlysis-vector；

3)采用电转化法将重组穿梭表达质粒导入App菌体，通过升温诱导制备App菌影，菌影冻干保存。

2.根据权利要求1所述的利用E.coli-App穿梭载体pMC-Express和双基因裂解制备App菌影的方法，其特征在于，包括步骤如下：

1)E、SN和E-15aa linker-SN基因的扩增

根据噬菌体PhiX174裂解基因E和金黄色葡萄球菌核酸酶A基因SN编码序列设计引物：

E1：5’-CAG GAATTC ATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3’(EcoRI)

E2：5’-GGC GTCGAC TTACTCCTTCCGCACGTAAT-3’(SalI)

SN1：5’-CAG GAATTC GCAACTTCAACTAAAAAT-3’(EcoRI)

SN2：5’-GGC GTCGAC TTATTGACCTGAATCAGCG-3’(SalI)

再设计含15个柔性氨基酸linker的引物，用于将裂解基因E和核酸酶A基因SN串联：

E2’：5’-TGC AGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCAGAACCACCACCACCCTCCTTCCGCAC-3’

SN1’：5’-GAG GGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCAACTTCAACT-3’

以噬菌体PhiX174双链DNA为模板，分别采用E1、E2和E1、E2’为上、下引物，扩增裂解基因E，得到两组产物，后者在E基因后带有linker；以金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923基因组DNA为模板，分别以SN1、SN2和SN1’、SN2为上、下游引物，扩增基因SN，得到两组产物，后者于SN基因前带有linker；以带有linker的E和SN基因为模板，以E1和SN2为引物，通过降落PCR法，得到双基因串联产物E-15aa linker-SN；

2)重组表达质粒及双基因裂解体系的构建

将获得的E、SN和E-15aa linker-SN与pMD-18T载体连接，转化感受态E.coli DH5α，抗性平板筛选阳性菌落后，提质粒酶切鉴定，获得重组克隆质粒pMD-E、pMD-SN和pMD-E-15aa linker-SN；双酶切pMD-E、pMD-E-15aalinker-SN和温控表达载体pBV220，经连接、转化、筛选重组子、提质粒酶切鉴定后，分别获得重组表达载体pBV-E和pBV-E-15aa linker-SN，通过菌体裂解试验，对温控裂解体系功能进行评价；

3)E.coli-App重组穿梭表达载体的构建

根据Genbank中λpL/pR-cI857温控启动子序列及pBV220质粒序列设计温控裂解盒上游引物λpL/pR-cI857FP，与SN基因下游引物SN2’结合，以pBV-E-15aa linker-SN为模板，对该融合基因进行扩增，引物序列如下：

λpL/pR-cI857 FP：5’-ATAGGGCCC TCAGCCAAACGTCTCTTCAG-3’(ApaI)

SN2’：5’-CGC GGATCC TTATTGACCTGAATCAGCGT-3’(BamHI)

扩增产物与pMD-18T载体连接，转化、筛选重组子，提质粒酶切鉴定后得到重组克隆载体携带的温控裂解盒；用ApaI和BamHI分别酶切穿梭载体pMC-Express和温控裂解盒克隆载体，胶回收试剂盒回收目的片段，以T₄DNA连接酶将线性化载体与目的片段进行连接，转化感受态细胞，筛选重组子，提质粒酶切鉴定后获得重组穿梭表达载体；

4)App重组菌的构建及菌影的制备

采用电转化法将重组穿梭表达质粒导入App菌体，通过升温诱导制备App菌影，以pMC-Express转化App菌为对照，测定温控双基因裂解系统对App菌的裂解特性，并镜检升温前后菌体的形态变化，获得App菌影。