[发明专利]低氧间充质干细胞的培养方法、用途及组合制剂

说明书

 

技术领域

本发明涉及干细胞应用技术领域，尤其是一种低氧间充质干细胞的培养方法、用途及组合制剂。

 

背景技术

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，属于非终末分化细胞，它既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为成纤维细胞、脂肪细胞、血管内皮细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞、胰岛β细胞和内皮细胞等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。间充质干细胞免疫源性低，不论是自体还是同种异源的间充质干细胞，一般都不会引起宿主的免疫反应。间充质干细胞有向衰退、缺血或损伤组织归巢的特征。间充质干细胞输入宿主体内后，可以归巢在特定部位，在微环境影响下有可能分化成为心肌、肝、肾、胰岛、神经、皮肤、肌肉、骨、软骨、肌腱等组织器官的细胞，达到治疗疾病的目的。

在临床应用方面，当前国内外的临床研究主要集中在用间质干细胞来治疗诊断明确的疾病上，尤其是难治疾病，如移植物抗宿主反应（GVHD）、牙周疾病、心肌梗死、半月板损伤、骨或软骨缺损、股骨头坏死、脊髓损伤、脑瘫、克隆氏病、肌萎缩侧索硬化症、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、中风、糖尿病、糖尿病足坏疽或肝脏损伤等疾病，部份疾病已取得明显的疗效，其余也得到了部分改善或缓解。大家公认的间充质干细胞在机体内的作用机制有：①干细胞分化为功能性细胞，代替衰退、损伤的功能性细胞；②启动再生相关基因的顺序表达，使组织器官的内源性衰退、损伤修复启动；③外源性干细胞进入体内，分泌多种生长营养因子，改善组织器官内部微环境；④免疫调节作用可减轻了局部组织器官的炎性反应。

当前针对间充质干细胞用于防治机体功能性衰退的研究尚少。机体功能性衰退（包括了亚健康、生理性衰退及疾病前期）与疾病的发生密切相关，可以说机体功能性衰退是疾病的前期，机体可同时存在机体功能性衰退和疾病两种情况，两者可互为因果条件相互促进，伴随着机体的整个生命周期。我们在进一步的研究中发现：①静脉输注的骨髓、外周血动员或体外培养的间充质干细胞，只有极少数间充质干细胞能植入受者体内，多数细胞滞留于微血管处而死亡。②间充质干细胞有贴壁生长的特性，间充质干细胞在静脉输注中会出现粘附、聚集成团，出现细胞团栓塞的可能。③胎盘、脐带来源的间充质干细胞取材方便、无道德伦理问题的限制，细胞的分化潜力、活力、增殖能力和细胞内的活性营养因子种类及含量，都强于来源于成体的间充质干细胞。目前还尚未发现有人将源于胎盘、脐带的间充质干细胞用于抗衰老目的。

 

发明内容

本发明的任务是要克服现有技术的缺陷，提供一种在人体内的活力及植入成活率高，具有防治机体功能性衰退，不会滞留于微血管处而死亡，在静脉输注中不会出现粘附、聚集成团从而导致细胞团栓塞，细胞的分化潜力、活力、增殖能力和细胞内的活性营养因子种类及含量都强于来源于成体的低氧间充质干细胞的培养方法、用途及组合制剂。

本发明的技术方案是：

一种低氧间充质干细胞的培养方法，其特征是：在3-10%氧浓度的低氧条件下，按如下步骤培养：a、无菌操作将脐带或胎盘切成组织块，用Hank^，s液冲洗后去除残留血液并分离血管；b、将处理后的组织块用胰蛋白酶消化，观察细胞大部分分散时，终止消化；c、对消化后的物质过滤；d、将所得滤液低速离心；e、在离心后的滤液中加入细胞培养液制成细胞混悬液；f、将细胞混悬液按（1：2～4）的比例历时约14-15天，进行4-5代传代，得成品低氧间充质干细胞。

进一步的该优化措施是：

在所述步骤f后还设有检验程序：g、对步骤f所得产物进行病源生物检测，排除病源学污染；h、进行表型检测，符合CD31、HLA-DR、CD34和CD45阴性，CD44、CD73、CD90和CD105阳性的细胞为合格细胞；i、将合格细胞加入冻存液后置于-205℃～-185℃液氮中保存，并记录脐带或胎盘的来源信息、细胞代数、细胞数量以及制备日期。

在于在所述步骤a中，将所述组织块切成0.5mm³～1.5mm³的小块。

在所述步骤d后设有步骤d’：用Hank^，s液对间充质干细胞混悬液离心清洗至少1次。

低氧间充质干细胞的用途，其特征是：所述低氧间充质干细胞在防治人或动物机体功能性衰退方面的应用。