[发明专利]复合检测禽流感和新城疫病毒的试剂盒及检验方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测禽流感病毒和新城疫病毒的试剂盒及检验方法，具体指一种双重TaqMan 探针法复合检测各亚型禽流感病毒和新城疫病毒中强毒的试剂盒及其检测技术。

背景技术

禽流感(avian influenza，AI)和新城疫(Newcastle disease，ND)是严重危害禽类的病 毒性疾病，常以单独或混合感染的方式感染家禽，发病率和死亡率都很高。禽流感除了可感 染禽类外，还可感染人、猪和马等多种动物。这两种疾病均可导致禽类出现呼吸系统疾病症 状。在流行病学、临床症状、病理变化等方面均有许多相似的地方，因此临床鉴别诊断存在 很大的困难。当这两种病毒混合感染禽类时，对其正确判断并进行防制也更加困难。

目前使用的传统方法(如病原分离及血清学方法)进行诊断不仅耗时费力，而且对混合感 染无能为力，其结果还会受到病料新鲜程度的限制。SYBR Green I荧光染料法虽然也能进行 复合定量检测，但该法却与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，特异性方面不 如TaqMan探针法。而且荧光染料法若要得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和 PCR反应的质量要求都非常高。目前国内外还没有应用TaqMan探针法，建立复合荧光定量 RT-PCR同时检测禽流感和新城疫的相关报道。

为有效防控禽流感和新城疫的爆发与蔓延，适应快速通关和控制禽肉携带病毒的要求， 显然利用TaqMan探针技术设计试剂盒，建立能进行早期、快速、灵敏和特异地鉴别方法是非 常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简单、结果准确的复合检测禽流感和新城疫病毒的试剂盒 及检验方法，解决混合感染的检测问题，以克服现有技术的不足。

本发明为实现上述目的，采用实时荧光定量TaqMan探针技术，该技术是在核酸水平上的 一种检测技术，具有准确性好、灵敏度高的特点。其原理是：利用Taq酶的3′→5′外切核酸 酶活性，采用特异性探针序列，进行一次实时荧光定量PCR反应就可以检出是否含有禽流感病 毒(AIV)或新城疫病毒(NDV)，无需针对两种病毒分别进行两次检测。

本发明的试剂盒包括以下组分：

1)裂解液：100％Trizol；

2)RT-PCR反应液：内含浓度为25mmol/L MgCl₂，10mmol/L dNTP Mixture；

3)引物及探针混合液；检测禽流感病毒上下游引物和检测新城疫病毒上下游引物按终浓 度为20pmol/L等比例混合，检测禽流感病毒探针和新城疫病毒探针按终浓度为10pmol/L等比 例混合；

本发明中所涉及的检测各亚型禽流感病毒的特异性核苷酸序列为：

1)禽流感病毒上游引物：5’-CGGACGAAAAGGCAACGA-3’；

2)禽流感病毒下游引物：5’-CATTGTCTCCGAAGAAATAAGATCCT-3’；

3)禽流感病毒探针：JOE-CGATCGTGCCCTCCTTTGACATGAGT-TAMRA； 检测新城疫病毒中强毒的特异核苷酸序列为：

4)新城疫病毒上游引物：5’-TGCTCACTCCTCTTGGYGAT-3’

5)新城疫病毒下游引物：5’-TGCTGTTAYCTGTGCCGCHG-3’

6)新城疫病毒探针：FAM-CACCTATAAAGCGTTTYTGTCTCCTTCCTCC-TAMRA

其中Y代表嘧啶，此处为T或C，H代表嘌呤和嘧啶，此处为A或C或T

作为探针的核苷酸序列在5’端和3’端分别连接荧光报告基团(禽流感为JOE，新城疫为 FAM)和荧光淬灭基团(禽流感和新城疫探针均为TAMRA)，具体设计要求如下：

其中，检测禽流感引物及探针选择自A型禽流感病毒共有的NP基因序列而设计，其GC含量 为40％-60％，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm 值)相差小于5℃。探针的长度为26个碱基，Tm值比引物Tm值稍高于5℃。实验证实检测禽流 感病毒的序列和探针能够检出禽流感病毒H5、H7、H9三种亚型，用其检测常见其他禽类病毒， 未出现交叉反应；