[发明专利]检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)技术领域。更具体地，本发明涉及用于检测动物源食品、血液及尿液中残留的盐酸克伦特罗(CBL)的含量的酶联免疫试剂盒以及使用该试剂盒的检测方法。

背景技术

盐酸克伦特罗(clenbuterol，CBL)是一种β-2肾上腺受体激动剂，临床上作为支气管解痉药物，对支气管平滑肌β-2受体具有兴奋作用。有研究显示盐酸克伦特罗能增强脂肪分解和减慢蛋白质分解代谢，在畜牧生产中大剂量使用可以明显提高饲料转化率和瘦肉率，因此又被称为瘦肉精。

但是，如果盐酸克伦特罗的用量过大，则会对动物和人的肝脏、肾脏等器官造成相当大的毒害作用，出现心跳加速、头晕、心悸、呼吸困难、肌肉震颤和头疼等中毒症状。盐酸克伦特罗还可通过胎酶标板屏障进入胎儿体内产生蓄积，从而对子代产生严重的危害。欧盟于1996年禁止在畜牧生产中使用该药，我国农业部也于1997年作出相同规定。但由于经济利益的驱使，目前在畜牧生产中使用盐酸克伦特罗的现象仍然存在，每年都有大规模中毒事件发生。

当前，造成瘦肉精屡禁不止的原因之一就是国内外检测盐酸克伦特罗的方法、手段还不完善。存在的问题主要有：检测方法灵敏度不高，准确度不够；特异性差，操作复杂，不能普及到基层。目前盐酸克伦特罗的检测方法主要有：色谱技术和免疫分析技术。色谱技术由于费时，花费多，在实际应用中受到一定限制，通常作为确定性的定量检验方法；酶联免疫分析方法(ELISA)是常用的现场抽样快速筛选检验方法，目前我国进出口检验检疫，兽医卫生部门及屠宰场多采用德国R-Biopharm公司生产的盐酸克伦特罗ELISA检测试剂盒(货号：R1701)，但由于进口试剂价格昂贵，在一定程度上限制了它的使用范围。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种能够快速且准确地检测出残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒。本发明所要解决的另一技术问题是提供一种操作简单、耗时短且检测灵敏度高的检测残留的盐酸克伦特罗的方法。

为解决所述技术问题，本发明的发明人通过深入研究和大量实验，提供以下技术方案来解决所述技术问题：

1.一种检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，包括微孔板(1)、盐酸克伦特罗标准品(2)、浓缩洗涤液(3)、浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)、酶标稀释液(5)、底物液(6)和终止液(7)，

其中，所述微孔板(1)是预先包被葡萄球菌蛋白A，然后包被兔抗盐酸克伦特罗抗体的微孔板，所述预先包被葡萄球菌蛋白A是用0.05mol/L的pH值为9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将葡萄球菌蛋白A稀释至1μg/ml，按每孔100μl的量添加到微孔板板(1)中，4℃放置过夜，弃去包被液，用稀释后的浓缩洗涤液洗板3次。

2.根据上述第1项所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述微孔板包被兔抗盐酸克伦特罗抗体是用0.05mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)将兔抗盐酸克伦特罗抗体以1∶50,000比例稀释，按每孔100μl的量添加到微孔板中，4℃放置过夜，弃去包被液，用稀释后的浓缩洗涤液洗板3次，然后真空抽干，将微孔板密封后置-20℃下保存。

3.根据上述第1项所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述盐酸克伦特罗标准品(2)的浓度分别为0μg/kg、0.02μg/kg、0.06μg/kg、0.18μg/kg、0.54μg/kg和1.6μg/kg。

4.根据上述第1项所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液(3)是5～10倍浓缩洗涤液，即在使用时将该浓缩洗涤液稀释5～10倍；

所述酶标稀释液(5)是由小牛血清和所述洗涤液按体积比1∶9组成；

所述浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)是10～100倍的浓缩酶标盐酸克伦特罗，采用重氮化-偶联的方法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到盐酸克伦特罗(CBL)上，用酶联免疫吸附试验测定酶标CBL原液的工作浓度，将酶标CBL原液用含10％小牛血清(体积比)的PBS稀释至工作浓度(浓度在0.1μg/mL～1μg/mL范围内)的10～100倍，该酶标CBL溶液即为10～100倍浓缩酶标CBL；