[发明专利]检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，包括微孔板(1)、盐酸克伦特罗标准品(2)、浓缩洗涤液(3)、浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)、酶标稀释液(5)、底物液(6)和终止液(7)，

其中，所述微孔板(1)是预先包被葡萄球菌蛋白A，然后包被兔抗盐酸克伦特罗抗体的微孔板，所述预先包被葡萄球菌蛋白A是用0.05mol/L的pH值为9.6的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液将葡萄球菌蛋白A稀释至1μg/ml，按每孔100μl的量添加到微孔板板(1)中，4℃放置过夜，弃去包被液，用稀释后的浓缩洗涤液洗板3次。

2.根据权利要求1所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述微孔板包被兔抗盐酸克伦特罗抗体是用0.05mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)将兔抗盐酸克伦特罗抗体以1∶50,000比例稀释，按每孔100μl的量添加到微孔板中，4℃放置过夜，弃去包被液，用洗涤液洗板3次，然后真空抽干，将微孔板密封后置-20℃下保存。

3.根据权利要求1所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述盐酸克伦特罗标准品(2)的浓度分别为0μg/kg、0.02μg/kg、0.06μg/kg、0.18μg/kg、0.54μg/kg和1.6μg/kg。

4.根据权利要求1所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液(3)是5～10倍浓缩洗涤液；

所述酶标稀释液(5)是由小牛血清和所述洗涤液按体积比1∶9组成；

所述浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)是10～100倍的浓缩酶标盐酸克伦特罗，采用重氮化-偶联的方法将辣根过氧化物酶(HRP)标记到盐酸克伦特罗(CBL)上，用酶联免疫吸附试验测定酶标CBL原液的工作浓度，将酶标CBL原液用含10％小牛血清(体积比)的PBS稀释至工作浓度(浓度在0.1μg/mL～1μg/mL范围内)的10～100倍，该酶标CBL溶液即为10～100倍浓缩酶标CBL；

所述底物液(6)包含5.37g/L的一水柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)、19.38g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、50mg/L的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)、25mg/L的过氧化氢脲和5％(体积比)的N，N-二甲基甲酰胺；

所述终止液(7)是0.5mol/L的盐酸。

5.根据权利要求4所述的检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含80g/L的NaCl、2g/L的KCl、29g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、2g/L的KH₂PO₄和5ml/L的吐温-20；以及所述浓缩酶标盐酸克伦特罗是20倍的浓缩酶标盐酸克伦特罗。

6.一种用权利要求1所述的试剂盒检测残留的盐酸克伦特罗的酶联免疫方法，其是基于抗原抗体反应进行竞争性抑制测定的方法，该方法包括以下步骤：

(I)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为体液样品，或者用有机溶剂提取待测样品、蒸干并且将其复溶于PBS制得溶液样品；

(II)取包被葡萄球菌蛋白A和盐酸克伦特罗抗体的包被板，加入50μL盐酸克伦特罗标准品和处理后的样品到对应微孔中；

(III)加入100μL用酶标稀释液(5)将所述浓缩酶标盐酸克伦特罗(4)稀释至工作浓度的酶标盐酸克伦特罗，振荡混匀后于37℃下避光静置孵育30分钟，用洗涤液洗涤3次，在吸水纸上拍干；

(IV)加入100μL底物液，于室温下避光静置10分钟，加入100μL反应终止液到微孔中，混合好后立即在450nm或双波长450nm/630nm测量吸光度值；

(V)以标准品测试的吸光度比值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中盐酸克伦特罗的含量。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤(II)中，盐酸克伦特罗标准品和处理好的样品同时添加到对应微孔中。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：

1)取尿液样品，离心(离心力为12000g)2分钟后取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍；

2)取血清样品，离心(离心力为12000g)2分钟后取上清，用0.15mol/L的pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释1倍；

3)取3.0克已均质后的猪肉样品于离心管中，加入6mL乙酸乙酯，漩涡混合1分钟，然后离心(3000rpm)10分钟，取2mL上层液(乙酸乙酯)，在50℃下氮气吹干，再加入正己烷1mL，待残余物完全溶解后，再加入1mL的含0.05％的吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)，漩涡混合30秒钟，离心(3000rpm)10分钟，吸去包含中间乳化层部分的上层液(正己烷)，吸取下层液(水层)作为处理后的样品。