[发明专利]检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列、方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列、检测人K-ras基因外显子12、13突变的方法及试剂盒。

背景技术

靶向治疗是近年来肿瘤领域的新热点，同以往经典的化疗治疗效果比较，靶向药物显著延长患者的无进展生存期(PFS)和整体生存期(OS)，同时降低药物的不良反应。美国FDA已经成功的将下列药物批准用于上述肿瘤的治疗，如：Trastuzumab(赫塞汀)治疗乳腺癌，Gefitinib(易瑞沙)和Erlotinib(特罗凯)治疗非小细胞肺癌，Cetuximab(爱必妥)治疗结直肠癌，Sunitinib(舒尼替尼)和Sorafenib(索拉非尼)治疗肾细胞癌。

由于在靶向治疗之前需要进行靶向诊断，所以如何准确地进行靶向诊断是决定治疗有效与否的前提。大量临床研究资料证实，Kras基因突变状态与针对EGFR的药物，如Cetuximab(爱必妥)和Panitumumab(帕尼单抗)等的疗效有关，应用抗EGFR的药物治疗肿瘤有必要检测Kras基因的突变。

Kras基因突变检测已被写入最新版的《NCCN结直肠癌临床实践指南》，新指南传递给广大医生和患者两条重要信息：一是所有转移性结直肠癌患者都应检测Kras基因状态；二是只对Kras基因野生型患者推荐介绍抗EGFR药物治疗。

K-ras基因，是人体肿瘤中常见的致癌基因，位于EGFR下游的Ras-Raf-Mek信号途径，该途径的异常也会导致肿瘤细胞的生长和肿瘤的进程。K-ras基因某些关键位点易发生突变，并且主要集中在特定的氨基酸密码子(第12、13、61密码子)上，其中12、13占所有突变的90％，这些突变使KRAS蛋白持续保持活化状态而不再受上游EGFR的调控，导致针对EGFR靶标的药物(Erbitux，Vectibix，Iressa，Tavceva等)失效。这种突变在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中发生率较高较为常见。

因此，Kras基因突变检测是目前医生了解结直肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法，通过检测不仅可以深入了解癌基因的情况，更重要的是筛选出针对抗EGFR靶向药物治疗有效的结直肠癌患者，帮助临床医生选择制定对肿瘤患者最有效的治疗方案。目前在欧美等发达国家，kras基因检测已经成为结直肠癌患者内科治疗前的常规检查。在通常情况下，60％左右的结直肠癌患者的kras基因是野生型的，如果都接受了Kras基因检测后，通过个体化的综合治疗方案，在化疗基础上加靶向药物，有效率可以达到60％左右，所以越早做Kras基因突变检测，患者获益越大。

随着分子生物学的发展，出现了很多检测基因突变的方法：

一、核苷酸序列测定法

核苷酸序列测定法是基因突变经典的检测方法，被誉为公认的金标准，目前国内外报道的发现的新的基因突变，大多采用DNA测序法，该方法虽然可靠直观，并可检测出多位点的变异，但耗时、灵敏度低，尤其在混合模板时，最低检出极限在10％以上。

二、基因芯片技术

基因芯片(genechip)，又称基因微矩阵(microarray)，其原理是将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针有序地和高密度地排列固定于玻璃或硅等载体上，然后与待测的有荧光标记的样品核酸按碱基配对的原则进行杂交，通过激光共聚焦系统检测杂交信号强度，经计算机分析处理数据资料，获取样品分子的数量和序列信息，从而可对核酸序列进行大规模、高通量的研究.基因芯片技术由于其具有大通量、快速、灵敏、平行检测基因的优势，已在生物学的各个领域中得到广泛的应用。但由于目前技术还不够成熟，所以有一定的假阳性和假阴性率，实验数据不容易解释，不可检测出新位点的变异。

三、聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性分析(RFLP)方法

错配PCR结合RFLP分析技术能有效地鉴别不同的基因型，实验简便、快速，无需特殊仪器，适合于一般实验室应用及大规模临床检验使用，但灵敏度不够，且该法操作中需开盖用PCR产物进行酶切，增加了产物污染的风险造成污染。

四、实时荧光定量PCR法：

近年来出现的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子生物学研究中的重要工具，实验诊断和操作严格的市场准入制度，基本解决了过去实验过程因污染出现的假阳性，成为临床诊断中首选的核酸诊断技术。