[发明专利]检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列、方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列，其特征在于，包含由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：10所示的任一核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列，其特征在于，SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列两端标记有JUP荧光集团，SEQ ID NO：4～10所示的核苷酸序列两端标记有MAR荧光集团。

3.根据权利要求1所述的检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1所示的上游引物、SEQ ID NO：2所示的下游引物、SEQ ID NO：3所示的野生型探和SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：10所示的突变型探针中的至少一个。

4.根据权利要求1所述的检测人K-ras基因外显子12、13突变的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1所示的上游引物、SEQ ID NO：2所示的下游引物、SEQ ID NO：3所示的野生型探针和SEQ ID NO：4～SEQ ID NO：10所示的突变型探针。

5.一种检测人K-ras基因外显子12、13突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取核酸样本；

(2)以步骤(1)提取的核酸为模板，用权利要求1至4任意一项所述的引物和探针序列，多重荧光PCR扩增病原体的靶核酸序列；

(3)采用荧光检测仪对扩增产物进行分析，并分析结果。

6.根据权利要求5所述的检测人K-ras基因外显子12、13突变的方法，其特征在于，所述的多重荧光PCR的反应体系为：50μL反应体系中含有：40μL反应体系中含有：2.5μL 10×PCR reaction buffer(Mg²⁺free)，3mmol/L Mg²⁺，0.125mmol/L dNTP，0.25μmol/L上游引物，0.25μmol/L下游引物，0.125μmol/L野生型探针，0.125μmol/L突变型探针，Taq聚合酶2U，UNG酶0.2U，模板量为3μL，补充水至40μL。

7.根据权利要求6所述的检测人K-ras基因外显子12、13突变的方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为40～43℃5～8分钟、94～96℃3分钟预变性；92～94℃5秒、58～60℃30秒，重复30～35个循环；最后37℃保温。

8.根据权利要求8所述的检测人K-ras基因外显子12、13突变的方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为42℃5分钟、95℃3分钟预变性；94℃5秒、60℃50秒，重复32个循环；最后37℃保温。

9.一种检测人K-ras基因外显子12、13突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～5任一所述的引物和探针。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的组成为：

PCR反应液840μl，国际单位比为10∶1的Taq聚合酶和UNG酶的混合物48μl，阴性对照品20μl，阳性对照品I 20μl，阳性对照品II 20μl；

其中，PCR反应液的组成为：10×PCR缓冲液4ml，25mmol/L dNTP0.2ml，50μmol/L上游引物0.2ml，50μmol/L下游引物0.2ml，50μmol/L野生型探针0.1ml，50μmol/L突变型探针0.1ml，用纯化水定容至35ml，充分混匀；

阳性对照I和阳性对照II分别为Kras野生型和突变型质粒DNA溶液；

阴性对照品为纯化水。

11.检测人K-ras基因外显子12、13突变的试剂盒在表皮生长因子受体抗体药物临床用药方面的应用。