[发明专利]一种新的miRNA检测技术及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域一种新的用于检测微小RNA(miRNA)所需试剂(盒)的制备、技术方法及其在临床医学、生物学和分子生物学等领域的应用。具体地说是一种基于荧光定量PCR技术应用MGB探针对成熟miRNAs进行高灵敏度、高特异性检测、鉴定的实验试剂设计、制备与技术方法应用。

背景技术

1 miRNA及其作用

小RNA是长度为19～28nt的RNA调控分子，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)和小干涉RNA(short-interfering RNA，siRNA)两类，miRNAs是继siRNAs之后新的研究热点之一，2002年和2003年被美国《科学》杂志评为年度十大科学成就[Couzin J.et al.Science，2002，298：2296-2297：Science，2003，302：2039-2045]。miRNAs是长片段RNA序列的一部分，同siRNAs一样是比较短小的单链小分子RNA，一般来源于染色体的非编码区域，由大约70nt大小的可形成发夹结构的前体加工而来，它通过与其目标mRNA分子的3’端非编码区域(3-untranslated region，3UTR)互补导致该mRNA分子的翻译受到抑制[Stark A，et al.Cell，2005，123(6)：1133]；miRNAs在表达上具组织和时间的特异性，是调节其他功能基因表达的重要调控分子，在基因的稳定和变异、疾病发生发展、细胞功能及信号转导等领域发挥重要作用[Akao Y，Biol PharmBull，2006，29：903-906]。截止到2009年9月，在miRNA公共数据库miRBase(htt-p://www.mirbase.org/)中已经有10883条来自不同物种的miRNA序列报道。

研究表明，miRNA与多种疾病的发生发展相关。如，miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用[Hammohd S M.CurrentOpinion in Genetics & Development，2006，16：1-6]，癌症的形成与miRNA对致癌和抑癌基因的调控有关；miRNA表达水平还与心肌肥厚、心律失常、血管内膜损伤和高血压[VanRooij E，et-al.Science，2007，316(5824)：575-579.]等心血管疾病有密切关联。

2 miRNA检测方法

miRNA表达水平的检测也是科学研究的热点。由于小分子RNA是一类很小的分子，部分小分子RNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具进行检测，目前常用的检测方法有：

2.1 Northern blotting：Northern blotting是目前检测miRNA表达的常用手段，该法是用探针与纯化RNA进行杂交来检测固相支持物(膜)上的目标分子，这种技术较为复杂且费力、费时。

2.2 RT-PCR：RT-PCR也被用来检测miRNA前体的表达水平，但miRNA前体的表达水平并不一定和成熟miRNA的表达水平一致。因此，在RT-PCR的基础上，人们改进了一些技术，从而使得能够检测低表达量的miRNA，而检测对象由前体miRNA转为成熟miRNA。荧光实时定量PCR(real-time PCR)可以很精确的定量分析miRNA的表达，也可以用于验证预测的miRNA，且具有特异性强、敏感性高、操作相对简单、耗时短、可进行高通量检测等特点。

2.3芯片(microarrays)技术：2004年Liu等最先发表了关于微阵列能够获得高通量的结果。这些结果显示了组织特异性miRNA的表达标记，并通过Northern blot和real-time PCR进行了验证。芯片技术有着高通量和平行处理的特点，但其弱点就是信号的稳定性和可重复性较差，灵敏度较低、价格昂贵、难以普及且不能进行精确定量检测。

综上所述，不难看出，以Real-time PCR法检测成熟miRNAs是具有很多优势的检测技术。但目前该方法使用的多是以非特异性荧光标记染料Sybrgreen为主的实验方法，降低了实验的敏感性和特异性。近来发现高度特异的MGB探针可用于定量有活性的成熟miRNAs检测，且不受其前体干扰，还可在高度同源性的miRNAs之间进行区分，甚至可以鉴定只有一个碱基的序列差异。

本发明的目的是研制一种基于荧光定量PCR技术的以高度特异的MGB探针为荧光标记的用于miRNA检测鉴定的试剂(盒)设计、制备及检测技术。