[发明专利]猪链球菌毒力因子的多重PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的多重PCR检测试剂盒及其检测方法，具体是一种猪链球菌毒力因子的多重PCR检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是一种重要的人畜共患病病原，在全世界广泛分布，引起仔猪的脑膜炎，关节炎，心内膜炎，败血症，肺炎以及断奶仔猪的猝死，并可感染人。根据菌体荚膜多糖抗原性的不同，分为35个血清型(1～34型及1/2型)。SS2，SS7，SS9是其中最重要的致病菌株，尤其以SS2流行最广，致病性最强。1991年在广东省首次分离鉴定到SS2，随后于1998年和2005年分别在江苏和四川部分地区暴发人感染SS2并致人死亡。

猪链球菌分为致病株和非致病株。致病株引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎等严重的临床症状，可致猪突然死亡，而且可引起人的感染并致死；非致病株常见于正常的猪的呼吸道，不引起临床症状。研究表明猪链球菌的致病性取决于其毒力因子，猪链球菌的主要毒力因子包括：荚膜多糖(cps)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fbps)、溶血素(sly)、毒力相关序列(orf2)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因。其中，cps基因可用于区分猪链球菌的血清型，gdh基因由于有很低的点突变率和高度保守性的特点常被用来作为猪链球菌感染的诊断抗原，gdh和cps同时又都是毒力因子。猪链球菌的致病性强弱取决于其毒力因子，特别是mrp和epf常作为判断致病性的指标之一。欧美等国家对部分毒力因子的分布情况已有报道，发现多种基因型，且致病性最强的基因型为cps2/epf+/mrp+/sly+，国内这方面的研究还不多。

经对现有技术的文献检索发现，公开号为CN1896279A的中国发明专利申请披露了一种猪链球菌2型三重PCR快速检测试剂盒，但该试剂盒并不能检测猪链球菌7型和9型的分型。近年来，虽无SS7、SS9所引起的猪链球菌病暴发流行，但国内外均有从病猪体内分离到SS7或SS9的报道，进一步的研究表明SS7、SS9有致病性，混合感染时在SS2致病或暴发流行中发挥协同作用，因此研制能够涵盖7种猪链球菌主要毒力因子(mrp、epf、sly、gdh、gapdh、orf2和fbps)和3种猪链球菌主要致病性血清型(2、7、9型)的多重PCR检测试剂盒十分必要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种猪链球菌毒力因子的多重PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明所建立的多重PCR检测方法特异、灵敏，且具有简便快捷的优点；试剂盒稳定性可靠，能用于临床样品的快速检测及猪链球菌的分子流行病学调查研究。

第一方面，本发明涉及一种猪链球菌毒力因子的多重PCR检测试剂盒，该试剂盒包含如下组分：2×PCR核心试剂预混物，猪链球菌2、7、9型阳性对照DNA，DL2000分子量参照溶液，ddH₂O和如下10种引物对：

引物对1：

碱基序列如SEQ ID NO：1所示的上游引物，

碱基序列如SEQ ID NO：2所示的下游引物；

引物对2：

碱基序列如SEQ ID NO：3所示的上游引物，

碱基序列如SEQ ID NO：4所示的下游引物；

引物对3：

碱基序列如SEQ ID NO：5所示的上游引物，

碱基序列如SEQ ID NO：6所示的下游引物；

引物对4：

碱基序列如SEQ ID NO：7所示的上游引物，

碱基序列如SEQ ID NO：8所示的下游引物；

引物对5：

碱基序列如SEQ ID NO：9所示的上游引物，

碱基序列如SEQ ID NO：10所示的下游引物；

引物对6：

碱基序列如SEQ ID NO：11所示的上游引物，

碱基序列如SEQ ID NO：12所示的下游引物；

引物对7：

碱基序列如SEQ ID NO：13所示的上游引物，

碱基序列如SEQ ID NO：14所示的下游引物；

引物对8：

碱基序列如SEQ ID NO：15所示的上游引物，

碱基序列如SEQ ID NO：16所示的下游引物；

引物对9：

碱基序列如SEQ ID NO：17所示的上游引物，