[发明专利]一种空肠弯曲菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)的核酸检测试剂盒及其检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是在世界范围内广泛流行的人兽共患病的重要致病菌，不但引起多种畜禽疾病，还能造成人类食物中毒，研究证明，人感染空肠弯曲菌，大多数情况下都直接或间接地与动物性食品有关。在各国各类细菌性的食物中毒中，空肠弯曲菌所导致的食物中毒常居前列，因此世界卫生组织已将该病列为最常见的食源性疾病之一。

空肠弯曲菌可存在于多类食品中，包括生肉、禽、蛋、奶制品、鱼、虾等食品。空肠弯曲菌在食品加工过程受伤而处于亚致死状态，并且在水中会进入一种“非可培养状态”，因此进一步增加了发生污染的可能性以及检测的难度。目前国内外报道的检测空肠弯曲菌的试剂盒筛选法，虽减少操作步骤、缩小了检测目标，但仍存在假阳性以及成本过高等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种空肠弯曲菌荧光定量PCR基因检测方法及其试剂盒，用该方法能够快速准确地检测空肠弯曲菌，减少了假阳性。

本发明提供一种空肠弯曲菌荧光定量PCR基因检测试剂盒，包括如下试剂：

(1)PCR MIX反应液：5×FQ PCR buffer、浓度为10uM的引物混合物、浓度为10uM的TaqMan探针混合物、浓度为10mM的dNTPs和ddH₂O，其中所述引物混合物中含有：16S rRNA上游引物F、16S rRNA下游引物R、上游引物hipO-F和下游引物hipO-R，TaqMan探针混合物中含有：16S rRNA-P和hipO-P；

所述16S rRNA上游引物F序列为：5’-TGCTTAACACAAGTTGAGTAGG-3’；

所述16S rRNA下游引物R序列为：5’-TTCCTTAGGTACCGTCAGAA-3’；

所述上游引物hipO-F序列为：5’-TAGGACTTCGTGCAGATATGG-3’；

所述下游引物hipO-R序列为：5’-AATCCATCTTCTATCATTGCCT-3’；

所述16S rRNA-P序列为：5’-AACCCTGACGCAGCAACGCCGC-3’(SEQID NO.3)，其5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；

所述hipO-P序列为：5’-AGCACCACCCAAACCCTCTTCAGC-3’(SEQ IDNO.6)，5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。

(2)Taq酶；

(3)阳性标准品和阴性标准品，所述阳性标准品是浓度为1×10⁷copies/mL的目的片段重组质粒。

所述PCR MIX反应液中所述5×FQ PCR buffer、引物混合物、TaqMan探针混合物、dNTPS和ddH₂O的体积混合比为10∶1∶0.5∶1∶30.5。

本发明还提供用权利要求1或2所述试剂盒检测空肠弯曲菌的方法，包括如下步骤：

(1)样品及阳性对照的DNA提取

(2)反应体系中含有：PCR MIX反应液24μL、Taq酶2μL，样品DNA提取液4μL，阳性模板为重组质粒，阴性模板为ddH₂O；反应程序为：93℃反应2min，93℃反应30s，58℃反应45s，45个循环。

(3)结果分析：Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为阳性，即样品中有空肠弯曲菌。

本发明用于空肠弯曲菌检测的荧光定量PCR方法及其试剂盒，实现了对空肠弯曲菌进行快速准确检测的目的。由于该方法引入了高效、特异性强的扩增引物和荧光探针，使得空肠弯曲菌检测的灵敏度和特异性得到很大程度的提高，并避免了漏检和误检。

具体实施方式

实施例1本发明试剂盒的组成