[发明专利]一种定向催化合成胞苷磷酰化合物的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及利用调控技术分别定向催化合成胞苷磷酰 化合物的方法。

背景技术

胞苷二磷酸(CDP)作为胞嘧啶的衍生物，是一种重要的生化试剂。它和二磷酸肌 苷在核苷酸磷酸酶的作用下制备聚肌胞(Poly I:C)。聚肌胞是一种高效的干扰素诱导剂， 具有广谱抗病毒及免疫抑制作用，广泛用于多种疾病的治疗。

胞苷三磷酸(CTP)是三分子的磷酸结合在胞苷核糖5’-OH基上的核苷酸，是机体 细胞内的一种正常成分，分布广泛，是RNA合成的直接前体。它在体内参与核酸和磷 脂类(卵磷脂，脑磷脂，丝氨酸磷脂、鞘磷脂等)的生物合成过程，磷脂是神经组织的 重要成分，也是一种天然的脂肪乳化剂，具有健全大脑和神经组织，增强智力和记忆力 并有促进体内胆固醇、脂肪的运输，改善脂肪代谢，从而防止堆积的作用。CTP作为生 化药物广泛用于治疗多种神经、血管疾病。

胞二磷胆碱(CDPC)，又称胞磷胆碱钠，是脑代谢激活剂，可促进神经细胞膜卵磷 脂的合成，具有修复脑损伤，抗缺氧，改善记忆，增强智力的作用，临床应用较广。所 以，胞二磷胆碱的合成技术是人们比较关心的研究课题。

CDP、CTP和CDPC均属于胞苷磷酰化合物的范畴。

目前，文献上所述的CDP制备方法有化学合成法和生物合成法两种。化学合成法 是以CMP为反应物，用二苯磷酰氯磷酸化，再精制得CDP。该法用到多种易挥发的有 毒试剂，操作环境恶劣，而且存在得率低，成本高的问题(Biochim.Biophys.Acta.，1964， 91(1)：1-13)。生物合成法分为两步，先将CMP合成CTP，再将CTP降解生成CDP，可 得到高纯度的CDP，得率在70％以上(化学与生物工程，2005，22(7)：52-54)。

CTP可以利用微生物(以啤酒酵母为主)细胞酶系合成。该工艺所需酵母的来源广， 成本低，受季节限制少；并且产率较高，具有挖掘改进潜力。是目前三磷酸胞苷主要的 生产方式之一。据报导，Kilajima等利用酵母，从CMP合成CTP，反应得率为80％(Hakko Kogaku Zasshi.1970，48(12)：753-762)。

目前常用CDPC合成方法是微生物转化法，利用微生物的细胞酶系合成。在酵母细 胞中，CMP可以在核苷酸激酶的催化下合成CDP；CDP可以在核苷二磷酸激酶的作用 下生成CTP，胆碱可以在胆碱激酶的催化下合成磷酸胆碱。然后CTP和磷酸胆碱经磷 酸胆碱胞苷转移酶催化可以生成CDPC与焦磷酸。但是由于细胞酶系复杂，存在反馈调 节作用，转化率普遍偏低，发酵周期太长，致使转化率、产品浓度较低，反应液中存在 大量副产物，包括CMP、CDP和CTP。目前国内还没有利用同一反应体系通过控制反 应温度和时间定向催化合成胞苷磷酰化合物的相关报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种微生物细胞定向催化合成上述三种胞苷磷 酰化合物的方法。

为解决上述技术问题，本发明的思路是：

鉴于CDPC的制备过程中，需要消耗大量的能量(ATP)，因此在胞苷磷酰化合物的 制备过程中需要两个酶系即ATP的再生体系和胞苷磷酰化合物合成酶系。ATP的再生 体系以廉价的葡萄糖为底物，通过糖酵解途径(EMP)来实现，该途径是能量再生的最 经济的途径之一；胞苷磷酰化合物合成酶系由核苷酸激酶、核苷二磷酸激酶、胆碱激酶 和磷酸胆碱胞苷转移酶构成。

在CDPC合成的整个过程中，胞苷磷酰化合物合成酶系由核苷酸激酶、核苷二磷酸 激酶、胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶起着关键作用。啤酒酵母中的这些酶分别具有不 同的最适温度。四种酶最适温度分别为胞苷酸激酶，25℃；核苷二磷酸激酶，37℃；胆 碱激酶，30℃；磷酸胆碱胞苷转移酶，30℃。我们可以通过控制反应温度及时间来生产 CDP、CTP和CDPC中任意一种产品。

本发明的关键在于：

1)本发明采用了全细胞催化技术，直接利用了细胞的自有酶系催化CMP合成三种 胞苷磷酰化合物，可以根据需求生产三种物质的任意一种，反应体系简单，无毒，生产 成本低廉。