[发明专利]一种二氢吡啶二羧酸合成酶

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种沙门氏菌(Salmonella typhimu-rium)来源的二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)。

背景技术

L-赖氨酸是人体必需氨基酸之一，能促进人体发育、增强免疫功能。由于谷物食品中的L-赖氨酸含量甚低，在加工过程中易被破坏，而人体及动物不能自己合成L-赖氨酸，只能从食物中获取，故称为限制性氨基酸。L-赖氨酸主要用于饲料添加剂以补充限制性氨基酸提高饲料的吸收利用率，食品添加剂，医药，化学制剂等。以年产量比较，L-赖氨酸目前是仅次于谷氨酸的世界第二大氨基酸品种，并且以5％-10％的年增长率增加。

国际上生产L-赖氨酸主要通过微生物发酵法。许多种类野生型或者诱变微生物都能够生产L-赖氨酸。基因工程大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌是主要的生产L-赖氨酸的微生物。

L-赖氨酸的合成途径在许多微生物中都是从天冬氨酸起始的，包括两步和甲硫氨酸和苏氨酸共用的步骤，经过九步的酶催化过程，最终产生L-赖氨酸。其中，天冬氨酸激酶(aspartate kinase)是天冬氨酸起始的第一个酶，二氢吡啶二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate synthase，DHDPS)是L-赖氨酸合成分支途径的第一个酶，它们的活力在微生物体内受复杂的调控，在一些革兰氏阴性菌中，天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶都受终产物L-赖氨酸的负反馈抑制。而在一些革兰氏阳性菌，这两种酶都对L-赖氨酸却不敏感。

DHDPS是L-赖氨酸合成分支途径的一个重要的酶，它的活力决定着代谢流流向L-赖氨酸合成途径的比例，因此，DHDPS的活力和其对L-赖氨酸反馈抑制的敏感性直接决定着L-赖氨酸合成的量。而专利号为6,040,160的美国专利所保护的大肠杆菌DHDPS正是经过突变增强了其对于终产物L-赖氨酸的抗反馈抑制能力。

利用基因工程大肠杆菌表达异源DHDPS，如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)和甲醇芽孢杆菌(B.Methanolicus)来源的DHDPS，生产L-赖氨酸均有见诸报道。由于异源的DHDPS在大肠杆菌体内受到了和本来源微生物体内不同的调控，或者在不同的催化环境中表现了不同的活力性质，如不同的发酵温度和pH，因此异源表达不同种类的DHDPS对于L-赖氨酸的产量有着不同的影响，寻找具有高比活和高抗L-赖氨酸反馈抑制能力的DHDPS需要进行大量工作，且存在很多困难。

发明内容

本发明的第一个目的，在于提供一种二氢吡啶二羧酸合成酶(DHDPS)，具有高比活和高抗L-赖氨酸反馈抑制能力。

本发明的第二个目的，在于提供一种所述二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA序列。

本发明的第三个目的，在于提供一种用于表达二氢吡啶二羧酸合成酶的重组质粒。

本发明的第四个目的，在于提供一种表达二氢吡啶二羧酸合成酶的重组菌株。

根据一个具体实施例，本发明的二氢吡啶二羧酸合成酶来源于沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。

根据一个优选实施例，所述二氢吡啶二羧酸合成酶经过了定点突变，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

根据另一个优选实施例，所述定点突变的二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。

根据一个优选实施例，本发明的用于表达二氢吡啶二羧酸合成酶的重组质粒包括上述二氢吡啶二羧酸合成酶的DNA序列以及一种合适的载体。

根据本发明，所述合适的载体优选的是pDCtet，或pDCkan。

根据一个具体实施例，本发明的表达二氢吡啶二羧酸合成酶的重组菌株转化有所述表达二氢吡啶二羧酸合成酶的重组质粒。

经验证，本发明的二氢吡啶二羧酸合成酶具有高比活和高抗L-赖氨酸反馈抑制能力，可用于高效生产L-赖氨酸，且相比野生型L-赖氨酸生产菌株，在发酵成本和生产效率方面具有明显的优势。

具体实施方式

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例中使用的菌株和质粒如下：

大肠杆菌BL21(DE3(Novagen))，质粒pET24a(Novagen)，pTRC99a(Pharmacia)，大肠杆菌DH5α(TaKaRa)。