[发明专利]快速沉淀分离肝素钠中多硫酸软骨素的方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及将多硫酸软骨素从肝素钠中分离出去的方法。

背景技术：

肝素钠来源于猪小肠粘膜，是一种含有硫酸基的酸性粘多糖，是典型的抗凝血药，能阻止血液的凝结过程，防止血栓的形成。因为肝素钠在α-球蛋白参与下，能抑制凝血酶原转变成凝血酶。肝素钠还具有澄清血浆脂质，降低胆固醇和增强抗癌药物的效用等作用。临床广泛用作外科手术前后防止血栓形成和栓塞，输血时预防血液凝固和作为保存新鲜血液的抗凝剂，广泛用于预防血栓疾病、治疗心机梗塞和肾病患者的渗血治疗，还可以用于清除小儿肾病形成的尿毒症。肝素软膏在皮肤病的治疗与化妆美容中也广泛应用。我国是肝素钠产量最大的国家，国际市场的肝素钠产品原料70％以上均来自中国。随着需求的增加，肝素钠的价格这几年一路攀升，因此有些肝素钠中被人为的加入多硫酸软骨素。多硫酸软骨素是一种类肝素物质，具有与肝素钠一样的抗凝血性质，其结构性质与肝素钠基本相似，经检测与肝素钠的区别在于：1、肝素钠是右旋结构，多硫酸软骨素是左旋结构；2、多硫酸软骨素的绝对分子量比肝素钠的大；3、核磁检测其峰值比肝素钠后出现。

2008年2月，美国因注射肝素钠出现4例死亡，多例不良反应的医疗事故，成为震惊世界的“肝素钠事件”。经有关专家分析，上述事故可能是因为肝素钠中含有多硫酸软骨素有关联。我国政府十分重视并关注事态发展，国家药监局召开专门会议，要求加强管理，一律召回含有多硫酸软骨素的肝素钠。

从肝素钠中分离多硫酸软骨素，迄今为止，除了有机溶剂萃取分离法外，未见其它有关分离技术的报道。而有机溶剂萃取分离法存在以下缺陷：一是由于多硫酸软骨素与肝素钠同属多糖类物质，对乙醇、丙酮等有机溶剂的溶解性非常低，因此有机溶剂萃取法分离效果不好，特别是肝素钠中多硫酸软骨素较高时分离效果更不明显。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种快速沉淀分离肝素钠中多硫酸软骨素的方法，利用多硫酸软骨素的绝对分子量比肝素钠大的特点，在酒精中多硫酸软骨素比肝素钠沉淀快，而肝素钠仍然留在上清酒精中，从而实现多硫酸软骨素与肝素钠的分离。

为了实现上述技术问题，本发明采取以下技术方案予以实现：

快速沉淀分离肝素钠中多硫酸软骨素的方法，包括下列步骤：

(1)溶解：在搅拌状态下，将粗品肝素钠加入反应釜内的水中，粗品肝素钠与水的重量比为1∶9-20，升温至55℃±5℃，搅拌4-6小时，使肝素钠完全溶解；

(2)过滤：过滤，收集滤液。

(3)树脂吸附：将滤液泵入处理好的吸附柱，流出的液体循环泵入吸附；

(4)清洗：待流出液效价检测恒定后，停止吸附；用水清洗干净树脂；再用3-5倍树脂体积的1.0-1.5mol/L盐水清洗树脂；

(5)洗脱：配制2-3倍树脂体积的3-4mol/L盐水洗脱树脂，收集洗脱液；

(6)一次醇沉：将洗脱液泵入醇沉罐，按体积的1-1.5倍加入重量浓度为95％、或95％以上的酒精，搅拌约半小时，静置约12小时，收集肝素钠沉淀；

(7)氧化：将肝素钠沉淀按10000-20000IU/L溶解于0.5-0.7mol/L氯化钠溶液中，用碱调PH10-12，再按体积的2-3％加入双氧水，在30-40℃下，氧化8-12小时；

(8)快速沉淀：氧化结束后，降温至10-20℃，将PH调至5-6，澄清过滤，收集滤液；搅拌下缓慢加入酒精至溶液中酒精的重量浓度为30-38％，再搅拌30分钟，静置；用搅拌棒试探罐底，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精转移至另一沉淀罐，收集沉淀；再静置，用搅拌棒试探罐底，只要有沉淀沉底，即可以将上层酒精转移至另一沉淀罐，再收集沉淀物；如此重复，直至连续静止4小时罐底没有沉淀，再向溶液中补加酒精至溶液中酒精的重量浓度为45-50％，静止沉淀10-12小时，将肝素钠完全沉淀；

分别将每次收集的沉淀物送检测，不含多硫酸软骨素的沉淀物合并后进入下一工序；

(9)脱水烘干：将步骤(8)的沉淀物加入酒精中，搅拌捣碎，溶液中的酒精重量浓度在85％以上，静止12小时，真空抽滤，得到的固体物在70-80℃真空干燥，即得到不含多硫酸软骨素的肝素钠。

步骤(8)所述的将沉淀物取样烘干检测，吸光度OD260应小于0.1，若不合格，应重复氧化和快速沉淀这两道工序过程，如合格才能进入下一工序。

与现有技术相比，本发明的优点是：