[发明专利]蛋白质定位标记方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质标记和修饰技术领域。

背景技术

点位突变是过去30年来蛋白质研究领域中最重要的技术突破。研究者可以利用这项技术将蛋白质中任何一个位点的氨基酸随意地变换成其它19种氨基酸中的一个。这项技术已成为蛋白质科学中主要的研究工具，在蛋白质的基础研究、蛋白工程与蛋白药物研发中得到广泛应用。

现行的点位突变技术的局限性在于氨基酸的变换只能在由遗传密码决定的20种天然氨基酸之间进行。数目众多的非天然氨基酸和带特殊标记的氨基酸则无法植入到蛋白质中指定的位点，其中最重要的一类是磷酸化的氨基酸。利用化学合成方法，这些特殊的氨基酸则可以合成到多肽中特定的位点。但是，用化学合成方法制备100残基以上的多肽是非常困难的。

由于现在没有定点标记的磷酸化蛋白及其它特殊修饰的蛋白，人们只能用相应的多肽替代。多肽只是蛋白中的一个小片段，完全丧失了蛋白质行使其特殊功能的基础及空间构象。因此磷酸化的多肽和其它特殊修饰的多肽在物理性质、稳定性、特异性及其它方面都和与其对应的蛋白存在重大区别。

利用蛋白拼接技术可以将一段蛋白和一段多肽通过形成肽键连接起来。如果要对蛋白的一个位点进行标记，可以首先合成一条带有标记的多肽，这条多肽的序列和蛋白标记位点的那一段的序列一致。然后，这条带有特殊标记的多肽和目标蛋白其余的片段通过蛋白拼接反应连接起来获得完整的目标蛋白。蛋白片段可以通过蛋白表达的方法获得。这个在指定位置带有特殊标记的完整的目标蛋白将进一步被折迭复性成具有天然构象的活性蛋白。

定点标记的蛋白分子具有普通蛋白无法获得的性质和功能，会在药物研发、疾病治疗以及科学研究等各领域得到广泛应用。其中特别重要的一类是定点标记的磷酸化蛋白。蛋白的磷酸化在细胞代谢调控中起着重要作用。细胞生长、凋亡及信号传递的一显重要调控线路是通过相应蛋白特殊位点的磷酸化和去磷酸化来实现的。许多重要疾病如糖尿病、自身免疫系统疾病，特别是肿瘤都是由于蛋白磷酸化失控而引起的。由于目前尚没有方法可以在体外获得定点标记的磷酸化蛋白，磷酸化蛋白的研究受到很大限制，在疾病治疗中的应用无法开展。

发明内容

本发明克服现有技术的缺陷，之目的在于提供蛋白定点标记方法，即通过定点标记技术将非自然氨基酸和带有标记的氨基酸，如D-型氨基酸、稳定同位素标记的氨基酸、萤光标记基团等，磷酸化氨基酸植入到蛋白的任何一个指定的特定位点。

为实现本发明目的，采用如下技术方案：

蛋白质定位标记方法，其特征在于包括：

1、蛋白质定位标记方法，其特征在于包括：

(1).N-S酯酰基重组

将目标蛋白的片段与内含肽形成的融合蛋白与几丁质亲和树脂结合，蛋白质内含肽N末端剪切点的半胱氨酸(Cys)残基侧链的N-S发生转酯酰基反应，形成一个线性中间产物；所述目标蛋白可以为动物蛋白或者植物蛋白、或者其它微生物蛋白。

(2).巯基小分子参与的转酯作用

转酯作用需要具有亲核残基的参与，含有巯基的小分子和目标蛋白结合生成C-末端含有硫酯基团的蛋白，并与亲和树脂上的融合蛋白的其余部分分离；

(3).多肽参与的转酯作用

加入含有N末端半胱氨酸(Cys)残基侧链的多肽分子，形成了一个含有多肽和目标蛋白的线性酯类中间体；

(4).S-N酯酰基重组

N末端多肽半胱氨酸(Cys)残基侧链发生S-N转酯酰基反应以肽键连接形成目标蛋白质。

上述含有N-末端Cys的多肽可由化学合成方法加上，或者用特异的蛋白水解酶酶切细胞表达的蛋白分子获得。

上述巯基小分子优选为巯乙基磺酸钠。

由于多肽化学合成方法不能合成长的多肽分子，大分子量的多肽可用蛋白质表达方式获得，而化学合成的方法可以得到带特异地修饰的多肽片段。利用蛋白拼接技术，可以将上诉一段蛋白和一段多肽通过形成肽键连接起来。另外，用于蛋白拼接的两条多肽，其中一条N-末端必须是半胱氨酸(Cys)，另一条C-末端必须含有硫酯基团(-NR)。含有N-末端半胱氨酸(Cys)的多肽可由化学合成方法加上。C-末端硫酯基团的蛋白质由蛋白质内含肽介异的蛋白质剪接方法获得。带有C-末端的硫酯基团的蛋白质与带N-末端半胱氨酸(Cys)的多肽分子形成天然肽键，从将两端分子连接起来形成稳定的蛋白分子。

本发明相比现有技术，具有如下技术效果：