[发明专利]蛋白质定位标记方法

权利要求书

1.蛋白质定位标记方法，其特征在于包括步骤如下：

(1).N-S酯酰基重组

将目标蛋白的片段与内含肽形成的融合蛋白与几丁质亲和树脂结合，蛋白质内含肽N末端剪切点的半胱氨酸(Cys)残基侧链的N-S发生转酯酰基反应，形成一个线性中间产物；

(2).巯基小分子参与的转酯作用

转酯作用需要具有亲核残基的参与，含有巯基的小分子和目标蛋白结合生成C-末端含有硫酯基团的蛋白，并与亲和树脂上的融合蛋白的其余部分分离；

(3).多肽参与的转酯作用

加入含有N末端半胱氨酸(Cys)残基侧链的多肽分子，形成了一个含有多肽和目标蛋白的线性酯类中间体；

(4).S-N酯酰基重组

N末端多肽半胱氨酸(Cys)残基侧链发生S-N转酯酰基反应以肽键连接形成目标蛋白质。

2.如权利要求1所述的蛋白质定位标记方法，其特征在于所述含有N-末端Cys的多肽可由化学合成方法加上，或者用特异的蛋白水解酶酶切细胞表达的蛋白分子获得。

3.如权利要求1所述的蛋白质定位标记方法，其特征在于所述巯基小分子为巯乙基磺酸钠。

4.蛋白质定位标记方法，其特征在于包括步骤如下：

(1).N→S酯酰基的重组：

将目标蛋白的基因插入含有内含子的pTWIN1，将载有该质粒的BL21细胞在含有100微克/毫升氨苄青霉素液体培养基中，37℃条件下生长到O.D.₆₀₀＝0.5-0.6，然后加入0.5mmol/L异丙基硫代半乳糖苷进行诱导合成蛋白质，在16℃下培养过夜或在30℃条件下培养3小时。

细胞以3000g、30分钟离心沉淀，然后悬浮在缓冲液A，所述缓冲液A包含20mmol/L Tris-HCl和500mmol/L NaCl溶液，用超声破碎细胞，以23000g，、30分钟离心去除细胞碎片，取上清加入用缓冲平衡后的几丁质树脂柱，不接合的蛋白质用10倍体积的缓冲液清洗去除；

(2).巯基小分子参与的转酯作用

加缓冲液B到几丁质树脂柱可快速激活由巯基试剂诱导的裂解反应，所述缓冲液B包含20mmol/L Tris-HCl，pH 8，含有500mmol/L NaCl和100mmol/L巯乙基磺酸钠，切割反应后，蛋白从柱中洗脱，接着在4℃过夜后，该蛋白自动生成一个带有C末端硫酯的蛋白；

(3)多肽参与的转酯作用；和

(4)S→N酯酰基的重组

将带有C末端硫酯的蛋白质和上述多肽直接混合，可以将上述一段蛋白和一段多肽通过形成肽键连接起来。