[发明专利]一种疏水层析分离纯化胞二磷胆碱的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物分离技术领域，具体涉及一种疏水层析分离纯化胞二磷胆碱的方法。

背景技术

胞二磷胆碱(CDP-choline)(I)为核苷衍生物，是磷脂酰胆碱的前体物质，可增加中枢神经系统的去甲肾上腺素和多巴胺水平。临床上广泛用于治疗各种脑血管疾病，老年性痴呆症、抑郁症，还对帕金森氏综合症、神经性耳聋和耳鸣，迟发性运动障碍、小脑与脊髓小脑共济失调有一定疗效。

在CDP-choline的全细胞催化转化液中，存在某些理化特性相似的化合物和中间代谢产物如胞苷一磷酸、胞苷二磷酸和胞苷三磷酸等，以及没有被转化完的底物如无机磷酸盐和葡萄糖等，另外还有细胞自溶产生的杂质如蛋白和核酸等化合物，分离难度极大。关于CDP-choline的分离纯化，国内外报道的较少，传统的分离工艺普遍存在着工艺冗长、产量收率低，分离成本高的缺点，并且离子交换过程采用乙醇-水的洗脱方式，有易燃、易爆特性，给生产带来安全隐患。藤原好孝等(日本特公昭62-16497)对化学法合成的CDP-choline溶液，使用强酸性离子交换树脂RHPK-25.4～60(H型)柱和弱碱性离子交换树脂RWA-30(OH型)柱两道工序分离纯化，经过液相色谱检测CDP-choline纯度可达98％，收率未报道。张剑等(CN101130797A)提出将转化液上碳柱，用纯水冲洗碳柱，再用乙醇碱溶液将CDP-choline洗脱下来，并收集；再将洗脱液汽化浓缩，将浓缩液稀释上大孔离子交换树脂柱，结束后水洗柱子，再洗脱并将洗脱液浓缩，然后将收集到的CDP-choline溶液加热送至超滤器除杂、脱色，加入乙醇搅拌，并放置冷库过夜；再将结晶液进行离心分离、真空干燥，烘干后装袋称重密封干燥保存。该工艺流程繁琐，产品损失率高。村田英城等(WO2007/018259A1.)用强酸性(H型)离子交换柱和活性碳柱分离纯化细胞转化液，产品收率仅为80％。徐仁华等(CN1944661A.)在上述基础上加以改进以活性碳为吸附载体，以Cl^-型离子交换树脂为分离载体分离纯化细胞转化液，产品收率略有提高。

这些方法虽然都实现了CDP-choline的分离，但均要使用两道树脂或活性炭柱，导致生产工艺冗长，产品损失率居高不下，成为其发展的瓶颈。邱蔚然等(CN101096380A.)首次提出了采用离子交换树脂组合层析法，分离CDP-choline，并同时回收未反应完的胞苷酸，该方法可以回收细胞转化液中少量的未反应的胞苷酸，但纯化过程CDP-choline的收率仅为80.9％，同样没能解决分离效率低，产品收率低的问题。

CDP-choline分子由胆碱和磷酸胞嘧啶核苷酸组成，经X光衍射测定，整个分子式高度卷起，多个分子聚合在一起，以5’-磷酸胞嘧啶核苷酸为核心，磷酸和胆碱部分暴露于外，与周围的水分子松散的结合，呈现一定的疏水性。利用这一特性，本发明将CDP-choline和疏水介质相结合，5’-磷酸胞嘧啶核苷酸基团会带动磷酸和胆碱部分有离开水相进入非极性相的趋势，即疏水性吸附。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种疏水层析法分离纯化胞二磷胆碱的方法，通过对CDP-choline转化液进行离心、超滤等处理后，再进行上柱吸附、洗脱过程，可得到高收率、高纯度的CDP-choline溶液。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

疏水层析法分离纯化胞二磷胆碱，包括如下步骤：

(1)胞二磷胆碱转化液经酶灭活、离心和超滤预处理；

(2)将预处理后的胞二磷胆碱转化液调pH2.0～14.0后，加入无机盐配制成含有0.01～5mol/L无机盐和0.1～40g/L胞二磷胆碱的上柱液，经疏水层析树脂吸附，再经pH2.0～14.0的纯水洗脱；

(3)将洗脱液经纳滤脱盐浓缩、结晶得到胞二磷胆碱。