[发明专利]木本植物的活体生长锥农杆菌转化法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物基因转化方法，特别涉及茶树等木本植物的活体生长锥农杆菌转化法。

背景技术

植物遗传转化是指通过某种技术或途径，将外源基因导入受体植物基因组中，使其在受体植物中稳定遗传，并赋予植物新的农艺性状，如高抗、高产、优质、代谢物质含量的显著变化等等。

植物遗传转化中，基因受体通常有体外培养材料和活体材料两类。利用体外培养材料如原生质体、悬浮培养细胞、愈伤组织、小孢子和原初外植体等作为基因受体，即通过组织培养和植株再生来实现遗传转化，是目前最主要的方法。此外，使用活体材料如完整植株、种子或花粉等作为基因受体，直接将外源基因导入受体植物也取得了成功。

植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、聚乙二醇转化法等，其中基因枪法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌转化法和病毒转化法两种，其中农杆菌转化法操作简便、成本低、转化效率高，广泛应用于双子叶植物甚至单子叶植物的遗传转化。

木本植物的遗传转化至今为止是一大难题。众所周知，木本植物在组织培养中经愈伤再生是非常困难的，这是限制木本植物通过组织培养和植株再生进行遗传转化的首要因素。此外，木本植物普遍含有大量的多酚，多酚在伤口细胞处迅速大量积累，对于植物来讲是一种自我保护机制，但伤口细胞处的多酚如果过重则对农杆菌介导的基因转化具有抑制作用，甚至对农杆菌本身具有杀伤作用，从而导致农杆菌转化法在木本植物基于组织培养和植株再生的遗传转化中表现出转化频率很低、效果不稳定、难于重演等问题。因此，着手木本植物遗传转化技术的优化和创新，对推进木本植物基因工程发展意义重大，同时也是利用现代分子育种技术培育优良品种的迫切需要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种木本植物的活体生长锥农杆菌转化法，突破了木本植物基因转化困难和再生困难两大技术瓶颈，不依赖于植物基因型和组织培养，具有转化效率高，操作简单，成本低廉等优点，适用于茶树等大多数木本植物，尤其是顶芽饱满的木本植物。

为达到上述目的，本发明的木本植物的活体生长锥农杆菌转化法，包括以下步骤：

a、农杆菌工程菌渗透转化液的配制：将含有目的基因的农杆菌工程菌接种于含有筛选压的液体培养基中进行培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.5～1.0时，向菌液中补加筛选压，并加入渗透剂和表面活性剂，配制成农杆菌工程菌渗透转化液；

b、活体生长锥的转化接种：在叶层平均温度为18～26℃、平均湿度为70～80％的条件下，将农杆菌工程菌渗透转化液注射至木本植物新梢顶芽芽苞内的生长锥上；

c、生长锥与农杆菌工程菌的共培养：将转化后的新梢顶芽在覆盖吸水保湿材料并用遮阳网遮阴降温保湿的条件下共培养2～10天，控制叶层平均温度为18～26℃、平均湿度为70～80％；

d、抗性芽的筛选：在共培养结束后，向新梢顶芽的生长锥上补加筛选压，抑制生长锥中非转化细胞的分裂，使转化细胞正常分裂并分化成抗性芽；

e、抗性枝条的培养：按常规方法进行田间施肥和病虫防治管理，及时剪掉未经转化处理的枝条，使抗性芽生长成抗性枝条；

f、转基因植株的鉴定：对抗性枝条进行转基因鉴定，结果呈阳性的植株即为转基因植株。

进一步，所述木本植物的顶芽饱满；

进一步，所述木本植物为茶树；

进一步，所述步骤a是将含有目的基因的农杆菌工程菌接种于含有筛选压、链霉素和利福平的LB液体培养基中进行培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.6～0.8时，向菌液中补加筛选压，并加入浓度为100g/L的蔗糖、体积百分浓度为0.02～0.05％的Silwet L-77和体积百分浓度为0.01～0.05％的吐温，配制成农杆菌工程菌渗透转化液；

进一步，所述步骤b是在木本植物新梢顶芽饱满的时期进行转化接种，且转化接种时不损伤或仅轻度损伤生长锥；

进一步，所述步骤c是先用吸水保湿性强的棉布覆盖转化后的新梢顶芽，再在棉布上覆盖50％～90％遮阳网，将生长锥与农杆菌工程菌共培养6天，其中前2天用蔗糖水溶液喷湿棉布保湿，后4天用水喷湿棉布保湿。