[发明专利]木本植物的活体生长锥农杆菌转化法

权利要求书

1.木本植物的活体生长锥农杆菌转化法，其特征在于：包括以下步骤：

a、农杆菌工程菌渗透转化液的配制：将含有目的基因的农杆菌工程菌接种于含有筛选压的液体培养基中进行培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.5～1.0时，向菌液中补加筛选压，并加入渗透剂和表面活性剂，配制成农杆菌工程菌渗透转化液；

b、活体生长锥的转化接种：在叶层平均温度为18～26℃、平均湿度为70～80％的条件下，将农杆菌工程菌渗透转化液注射至木本植物新梢顶芽芽苞内的生长锥上；

c、生长锥与农杆菌工程菌的共培养：将转化后的新梢顶芽在覆盖吸水保湿材料并用遮阳网遮阴降温保湿的条件下共培养2～10天，控制叶层平均温度为18～26℃、平均湿度为70～80％；

d、抗性芽的筛选：在共培养结束后，向新梢顶芽的生长锥上补加筛选压，抑制生长锥中非转化细胞的分裂，使转化细胞正常分裂并分化成抗性芽；

e、抗性枝条的培养：按常规方法进行田间施肥和病虫防治管理，及时剪掉未经转化处理的枝条，使抗性芽生长成抗性枝条；

f、转基因植株的鉴定：对抗性枝条进行转基因鉴定，结果呈阳性的植株即为转基因植株。

2.根据权利要求1所述木本植物的活体生长锥农杆菌转化法，其特征在于：所述木本植物的顶芽饱满。

3.根据权利要求2所述木本植物的活体生长锥农杆菌转化法，其特征在于：所述木本植物为茶树。

4.根据权利要求1至3任一项所述木本植物的活体生长锥农杆菌转化法，其特征在于：所述步骤a是将含有目的基因的农杆菌工程菌接种于含有筛选压、链霉素和利福平的LB液体培养基中进行培养，当菌液OD₆₀₀值达到0.6～0.8时，向菌液中补加筛选压，并加入浓度为100g/L的蔗糖、体积百分浓度为0.02～0.05％的Silwet L-77和体积百分浓度为0.01～0.05％的吐温，配制成农杆菌工程菌渗透转化液。

5.根据权利要求1至3任一项所述木本植物的活体生长锥农杆菌转化法，其特征在于：所述步骤b是在木本植物新梢顶芽饱满的时期进行转化接种，且转化接种时不损伤或仅轻度损伤生长锥。

6.根据权利要求1至3任一项所述木本植物的活体生长锥农杆菌转化法，其特征在于：所述步骤c是先用吸水保湿性强的棉布覆盖转化后的新梢顶芽，再在棉布上覆盖50％～90％遮阳网，将生长锥与农杆菌工程菌共培养6天，其中前2天用蔗糖水溶液喷湿棉布保湿，后4天用水喷湿棉布保湿。