[发明专利]鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒及使用方法

说明书

技术领域

本发明属于水产动物、海产品及海水污染的监测技术。特别是水产养殖动物的哈维氏弧菌感染的检测--鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒及使用方法。

背景技术

哈维氏弧菌广泛存在于海洋环境中，是引起水产动物感染致病的主要菌源，能引起水产动物的皮肤溃烂、肌体出血和大批死亡，危害十分巨大。已有的研究表明，哈维氏弧菌携带的溶血素是水产动物的致病因子即感染致病的根源，对于哈维氏弧菌的检测方法，目前主要有生理生化检测方法、荧光抗体技术、酶联免疫吸附试验、rRNA基因探针杂交技术等。但这些方法存在一些缺点和不足：生理生化检测十分耗时耗力、结果不稳定；荧光抗体技术需要较昂贵的仪器设备；酶联免疫吸附实验灵敏度不高，且易受干扰、rRNA基因在物种中非常保守，使得技术特异性不强。目前的PCR虽然是一种具有灵敏度高、特异性强的靶DNA快速检测方法，样品中含有少量的致病因子就能检出。然而，已有的PCR检测技术方法较为繁琐，且对哈维氏弧菌检测识别率较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种鱼类哈维氏弧菌的PCR快速检测试剂盒及使用方法，以快速检测和判定或者监测水产动物、海产品及哈维氏弧菌污染的海水，弥补现有技术的不足。

研究表明：哈维氏弧菌携带的溶血素是水产动物感染致病的根源，即本发明所指的致病因子，快速检测样品中的致病因子基因即可判断水产动物是否感染致病，从而为进一步为防治感染提供依据。本发明在克隆出哈维氏弧菌致病因子的编码基因，分析其序列特征的基础上，以该特异基因的保守区段设计特异性引物，并且采用PCR快速技术检测哈维氏弧菌，具有准确、快速、灵敏等优点。可作为水产养殖鱼类疾病的快速、简便、准确的检测方法，也可用作养殖水体、饲料和海产品的质量检测以及海水污染的监控。

本发明的主要原理为：裂解液将样品中的细菌进行裂解，释放出细菌DNA，加入PCR反应试剂和Tag酶等，以哈维氏弧菌致病因子的特异DNA片段引物为模板，对样品中释放出的哈维氏弧菌致病因子DNA进行专一性扩增，浓度达到可检测范围后进行检测。由于设计的特异引物为哈维氏弧菌所特有，因此，样品中含有的哈维氏弧菌就被会被检出。

本发明的PCR快速检测试剂盒包括以下7种试剂：

(1)裂解液：含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，pH为7.5-8.5，其浓度分别为1-10mg/mL，10-50mmol/L，1-10mmol/L；

(2)PCR反应液：含dNTP和MgCL₂溶液

dATP，dTTP，dCTP和dGTP的四种混合物dNTP，其中每种浓度2.0-3.0mmol/L；浓度为20-30mmol/L的MgCL₂溶液；

(3)Taq酶液：3U/μL；

(4)引物对：

所述的引物对是人工设计并人工合成的DNA片段，碱基序列分别为：

上游引物：5’-GAAAACCAATACATCGCTCTGACT-3’，10-20μmol/L

下游引物：5’-TTGACAATTGATTCGTACTTTCTAGC-3’，10-20μmol/L

(5)灭菌去离子水

(6)阳性对照

(7)阴性对照。

本发明使用PCR快速检测试剂盒检测哈维氏弧菌的方法，其特征在于检测程序如下：

a.待检样品的处理及模板DNA制备

待检样品经无菌生理盐水清洗后，取0.1-0.2g待检组织于洁净的灭菌匀浆器中，加入0.5-1.0mLTE缓冲液，充分研磨，取0.5-1.0mL样品液于1.5mL灭菌离心管，用于提取模板DNA。

将上述模板DNA于100℃水浴保持10-15分钟。冷却后于4℃12000rpm离心10分钟，吸取上清200μL作为PCR模板，并于-20℃保存。

海水样品不需要样品处理，可直接进入PCR扩增。

b.PCR扩增

在一个PCR管内加入1μL模板DNA，9μLPCR反应液，1μL酶液，1μL引物，用灭菌去离子水补足到50μL，在3000g离心5秒钟混匀，置于PCR仪中进行扩增使扩增倍数达到10⁷左右。同样制作其它待测样品以及阳性对照和阴性对照品。

PCR扩增条件：94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，如此进行25个循环，然后72℃延伸10分钟。

本发明的PCR快速检测结果判定方法：