[发明专利]鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒及使用方法

权利要求书

1.一种鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒，其特征在于包括以下7种试剂：

(1)裂解液：含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，pH为7.5-8.5，其浓度分别为1-10mg/mL，10-50mmol/L，1-10mmol/L；

(2)PCR反应液：含dNTP和MgCL₂溶液；

dATP，dTTP，dCTP和dGTP的四种混合物dNTP，其中每种浓度2.0-3.0mmol/L；浓度为20-30mmol/L的MgCL₂溶液；

(3)Taq酶液：3U/μL.；

(4)引物对：

上游引物：5’-GAAAACCAATACATCGCTCTGACT-3’，10-20μmol/L

下游引物：5’-TTGACAATTGATTCGTACTTTCTAGC-3’，10-20μmol/L

(5)灭菌去离子水

(6)阳性对照

(7)阴性对照。

2.根据权利要求1所述的鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒，其特征在于所述PCR试剂的最佳成分为：

PCR反应试剂最佳用量：

  试剂盒试剂组成(25个反应)  体积  (1)裂解液  20mL(25x800μL)  (2)PCR反应液  225μL(25x9μL)  (3)Taq酶液  25μL  (4)PCR引物  25(25x1μL)  (5)灭菌去离子水  1000μL  (6)阳性对照  25μL  (7)阴性对照  25μL

3.利用上述鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒检测哈维氏弧菌的方法，其特征在于检测程序如下：

a.待检样品的处理及模板DNA制备

待检样品经无菌生理盐水清洗后，取0.1-0.2g待检组织于洁净的灭菌匀浆器中，加入0.5-1.0mL TE缓冲液，充分研磨，取0.5-1.0mL样品液于1.5mL灭菌离心管，用于提取模板DNA；

将上述模板DNA于100℃水浴保持10-15分钟，冷却后于4℃12000rpm离心10分钟，吸取上清200μL作为PCR模板，并于-20℃保存；

海水样品不需要样品处理，可直接进入PCR扩增；

b.PCR扩增

在一个PCR管内分别加入1μL模板DNA，9μLPCR反应液，1μL酶液和1μL引物，然后用灭菌去离子水补足到50μL，在3000g离心5秒钟混匀，置于PCR仪中进行扩增使扩增倍数达到10⁷左右；同样制作其它待测样品以及阳性对照和阴性对照品；

PCR扩增条件：94℃预变性3分钟，并且分别以94℃变性1分钟，58℃退火1分钟和72℃延伸1分钟，如此进行25个循环，然后72℃延伸10分钟。

4.根据权利要求1所述的鱼类哈维氏弧菌PCR快速检测试剂盒，其特征在于PCR快速检测结果判定方法：

取已加入0.25-0.75％澳酚蓝上样缓冲液的10μL PCR产物，加于含有溴化乙锭浓度为0.5-1.0μg/mL的1.2-2.0％琼脂糖凝胶中，在100-150v电压下电泳25-30分钟，取电泳结束后的凝胶在紫外透射仪下观察，当在622bp出现特异核酸条带，即可判断样品中含有哈维氏弧菌，反之则没有。