[发明专利]一种融合基因片段rolB-FGFs及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，确切地说一种融合基因片段rolB-FGFs及应用。

背景技术

FGFs(fibroblast growth factors)，在细胞的增值、变异和正常的生长上都是有效的调节剂，它参与病理中肿瘤的处理和转移(Gaizie，et al，Biochem，Cell Biol，1997，75：669)。FGFs具有广泛的生物学活性，它来源于神经组织、垂体、肾上腺皮质、视网膜、黄体和胎盘等，能刺激所有源自中胚层的细胞以及许多源自神经外胚层和内胚层细胞的增生。在体内，FGFs对内皮细胞有趋化和促有丝分裂作用，促进血管形成；参与细胞过度增生和血管过度形成所引起的多种病理损害。FGFs被认为是刺激血管细胞增殖、迁移和分化的第一分子，是典型的血管生长因子。FGFs具有广泛的生物学效应。研究发现，FGFs对体外培养的成纤维细胞有促有丝分裂作用。FGFs参与创伤修复，可能是诱发毛细血管内皮细胞增殖，刺激内皮细胞迁移，诱发新毛细血管生长，增加毛细血管网络.使损伤组织血管化。FGFs还可促进成纤维细胞生长、增殖，促进皮肤再生。迄今为止，至少已经知道23个FGF家族的成员，其中aFGF和bFGF是FGF家族的典型成员，研究的比较成熟，但目前FGF家族的成员大多是通过原核系统或部分真核系统表达出来的，几乎很少通过植物系统表达，尤其是植物发状根系统。

近几年来，利用植物生物反应器表达生产具有临床应用价值的药用蛋白(包括疫苗、抗体)已成为生物制药产业的热点领域，具有极大的市场前景和商业价值，日益引起人们的关注.但植物生物反应器在研究的过程中，逐步发现许多问题，如蛋白产量低、下游加工(目的蛋白的提取纯化)困难以及由此而引起的高成本等.因此，结合植物自身结构特点，发展植物发状根表达系统，不但可以提高植物本身的次生代谢产物含量，同时可以省略下游加工过程，利于产业化开发，因此本发明采用植物发状根系统生产FGFs蛋白，这将结合医药与食品领域，开发出功能性食品与药品的一条重要途径。

利用分泌途径可以有效地提高外源蛋白的表达量。一般真核生物分泌蛋白N端都有信号肽序列，引导蛋白定位于内质网膜，经高尔基体加工后，运送到细胞的各个部位。在利用生物反应器表达外源蛋白的时候，外源蛋白可以在信号肽的引导下到达细胞的特定部位，或分泌到细胞外，这样可以避免宿主细胞把外源蛋白视为异己蛋白而降解，从而提高了外源蛋白的表达量。应用信号肽引导外源蛋白分泌表达也是近年来的研究热点。

转基因植物中标记基因的安全性从一开始就受到了广泛争论。人们担心在转基因作物的商品化种植过程中，除草剂基因可能经自然杂交，抗生素基因可能通过转染肠道细菌，从而造成自然界的非转基因作物对除草剂、人类对抗生素产生抗性。近年来，人们开始采用一种新型的正筛选方法——甘露糖筛选体系。该体系以大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因为标记基因，甘露糖为筛选剂进行筛选。目前，PMI/甘露糖筛选体系已成功用于甜菜、拟南芥、玉米、小麦、水稻、木薯等植物。

实验证明，发状根具有细胞培养和一般器官培养所不能兼备的特点，几乎所有双子叶植物中由根部合成的次生代谢物质都可以通过发状根来生产，这一生物技术为植物有用成分的大量生产提供了新的途径，日益引起人们的关注。发状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术，它将发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri质粒中的T-DNA整合到植物细胞的DNA上，诱导植物细胞产生发状根。发状根培养是获得有用次生代谢产物的重要途径。

对于任何一种类型的发根农杆菌而言，其菌体内部存在着大小各异的3种质体，例如：在A4菌株的菌体内，存在着pRiA4a、pRiA4b和pRiA4c3中质粒，其中pRiA4b质粒与发状根的诱发有关，它的物理结构见图1。从图1可以看出，农杆碱型Ri质粒有两个T-DNA区，即T_L-DNA和T_R-DNA，这两段T-DNA之间隔着一段15kb的非转移DNA。T_L-DNA大小为19～20kb，包括4个与发状根形态发生有关的位点：rolA、B、C、D，rolA基因在营养阶段和生殖阶段表达强烈，而在种子中不表达。rolB基因是形成毛状根的关键基因，其表达引起植株产生大量的毛状根。rolB基因主要限于在分生组织的原始细胞和韧皮部的薄壁组织细胞表达。rolC基因在烟草中表达导致植株变矮、顶端优势减弱、叶片色素含量下降、雄性不育。