[发明专利]一种融合基因片段rolB-FGFs及应用

权利要求书

1.一种融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根据植物密码子的偏好性设计的FGFs基因组成。

2.根据权利要求1所述的一种融合基因片段rolB-FGFs，其特征在于：其碱基序列如SEQID NO.8或9或10所示。

3.无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体，包含无抗生素标记的PIM基因、分泌型表达的信号肽基因SEAP和权利要求1或2所述的一种融合基因片段rolB-FGFs的pCAMBIA1390，即：pCAMBIA 1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs。

4.一种发根农杆菌，它转化了权利要求3所述的无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体pCAMBIA 1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs。

5.含有FGFs植物发状根，它是下述方法生产的：

1)人工设计合成下述引物：

R1：GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACC

R2：TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCG

Fp1：CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCA

Fp2：GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG

2)以发根农杆菌A4中的Ri质粒为模板，用引物R1、R2进行PCR扩增，获得rolB基因；以质粒PUC-FGFs为模板，用引物Fp1、Fp2，经PCR扩增，获得FGFs基因；

3)以获得的rolB基因和FGFs基因为模板，利用引物R1和Fp2，通过PCR搭桥法，将rolB基因与FGFs基因进行融合，获得融合基因rolB-FGFs；

4)SEAP信号肽分泌表达载体的构建，人工合成SEAP信号肽基因，两端引入kpn I、Nco I和BstB I、EcoR I酶切位点，与经kpn I和EcoR I双酶切的pCAMBIA1390-PIM载体进行连接；

5)将融合基因rolB-FGFs和经EcoR I和Bgl II双酶切，rolB-FGFs融合基因片段与pCAMBIA1390-PIM-SEAP经EcoR I和Bgl II双酶切后的载体大片段进行连接，构建重组的无抗生素标记的植物双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs；

6)无抗生素标记的植物双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs转化发根农杆菌A4中，活化含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌A4；

7)含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌感染植物，培养发状根；

8)获得的含有FGFs的发状根进行大规模培养。

6.根据权利要求5所述的含有FGFs植物发状根，其特征在于：所述的植物为人参、西洋参或丹参，融合基因rolB-FGFs其碱基序列如SEQ ID NO.8或9或10所示。

7.根据权利要求6所述的含有FGFs植物发状根，其特征在于：所述的FGFs为FGF1。

8.根据权利要求5、6或7所述的含有FGFs植物发状根及其培养液，经分离纯化，生产FGFs的应用。

9.根据权利要求6或7所述的含有FGFs植物发状根，用于制备保健品的应用。