[发明专利]一种蔗糖异构酶基因及其高效表达方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种蔗糖异构酶基因及其高效表达方法。

背景技术

蔗糖异构酶(Sucrose isomerase，简称SIase)是生产功能性甜味剂异麦芽酮糖(醇)和海藻酮糖的关键酶。异麦芽酮糖醇是近年来新兴的一种功能性糖醇，它是由异麦芽酮糖经镍催化加氢制得。它除了具有一般糖醇的共同特点外，还具有木糖醇和麦芽糖醇等功能糖醇无法比拟的极低的吸湿性和纯正的口感。由于其独特的性能，受到了食品界制取无糖甜食品的欢迎，特别是近年来，随着人们对自身健康的重视，异麦芽酮糖醇的生产和开发利用受到了广泛关注。在欧洲上市不到5年，销售量已经达到10万吨以上，国内市场刚刚起步，预计其需求量年增长率在10％以上。

目前国内外生产异麦芽酮糖普遍采用SIase催化蔗糖而进行的。该反应可以同时生成异麦芽酮糖和海藻酮糖两种同分异构体，根据主产物的不同分为异麦芽酮糖主产型和海藻酮糖主产型。所报道的SIase生产菌种中，大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)，沙雷氏菌(serratia plymuthica)，克雷伯氏菌(Klebsiella sp.LX-3)和多源发散菌(Pantoeadispera)可以生成70～85％的异麦芽酮糖，而嗜中酸性假单胞菌(Pseudomonasmesoacidophila MX-45)，放射性土壤杆菌(Agrobacterium radiobacterMX-232)生成90％以上的海藻酮糖。

目前，许多SIase酶已经得到了纯化，相应SIase的编码基因得到了克隆。由于分泌SIase的野生菌株的生产能力普遍较低，为了克服野生菌的低生产能力，采用基因工程菌高效表达SIase引起了人们极大的兴趣。在国内，SIase的克隆与表达迄今为止鲜有报道，国内有限的研究仍主要致力于提高原始菌株的酶产量。因此构建高效的基因工程菌是降低SIase生产成本的关键。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种优质的蔗糖异构酶基因。

本发明还要解决的技术问题是提供上述蔗糖异构酶基因所编码的蛋白质。

本发明还要解决的技术问题是提供包含上述蔗糖异构酶基因的表达载体。

本发明还要解决的技术问题是提供包含上述表达载体的重组大肠杆菌。

本发明还要解决的技术问题是提供利用上述重组大肠杆菌高效表达蔗糖异构酶基因的方法。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组大肠杆菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种蔗糖异构酶基因(即pal I基因)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。该基因是从大黄欧文菌(Erwinia rhapontici)NX-5(CGMCC NO：2222)(200710190755.2)中提取获得，共1803bp。

一种权利要求1所述基因的编码蛋白质(即蔗糖异构酶，缩写SIase)，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共601个氨基酸。

一种表达载体，包含如SEQ ID NO：1所示的蔗糖异构酶基因。

上述表达载体，优选为重组表达载体pET22b(+)。

一种重组大肠杆菌，包含如SEQ ID NO：1所示的蔗糖异构酶基因。

上述重组大肠杆菌，优选为包含有重组质粒pal I/pET22b(+)的E.coli BL21(DE3)。

利用上述重组大肠杆菌细胞高效表达pal I基因的方法，即上述重组大肠杆菌细胞自诱导产酶的方法，是以糖蜜水解液为诱导剂诱导培养重组大肠杆菌产酶。糖蜜水解液即作为碳源又作为诱导剂。

利用上述重组大肠杆菌细胞高效表达pal I基因的方法，具体为：将重组大肠杆菌在含有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中30～40℃液体培养8～20h，转接至发酵培养基培养5～7h后降温至25～30℃再诱导培养6～12h；所述的发酵培养基为：糖蜜水解液10～50mL/L，(NH₄)₂SO₄ 5～10g/L，NaCl 5～10g/L，KH₂PO₄ 1～3g/L，MgSO₄ 0.1～1g/L。