[发明专利]一种人TSHR胞外段融合蛋白及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及人TSH受体的重组和生物工程制备，特别涉及一种人TSHR胞外段融合蛋白及其制备方法。

背景技术

自身免疫性甲状腺病(Autoimmune thyroid disease，AITD)属于器官特异性疾病，包括Graves病(Graves’disease，GD)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’sthyroditis，HT)及特发性黏液性水肿(Primary myxedema，PM)，其发病率占内分泌系统疾病的首位。促甲状腺激素受体(thyrotropin receptor，TSHR)是诱发AITD的主要抗原。

人TSHR分子量为84.5KD，糖基化后达100KD，与AITD的发病关系密切。人TSHR主要存在于甲状腺细胞膜上，属于鸟嘌呤核苷酸调节蛋白(G蛋白)耦连受体超家族成员之一；由膜外区、跨膜区和膜内区三部分组成：膜外区有397个氨基酸残基，含有N-端、5个糖基化位点和两个具有免疫原性的肽段。

在生理情况下，促甲状腺激素(TSH)与TSHR结合后，通过腺苷酸环化酶AC-cAMP通路和磷脂酶C-二酰甘油及磷酸肌醇通路调节甲状腺细胞的生长、分化和功能。AITD发病时，免疫功能异常的机体针对TSHR产生了自身抗体(Thyrotropin receptor antibody，TRAb)。TRAb属多克隆抗体，作用于TSHR膜外区(TSHRecd)的不同位点，依其功能的不同分为三种：(1)甲状腺刺激性抗体(Thyroid stimuLating antibodies，TSAb)：通过激活腺苷酸环化酶-cAMP通路，过度刺激甲状腺滤泡的功能和生长，引起甲状腺功能亢进；(2)甲状腺刺激阻滞抗体(Thyroid-stimuLating blocking antibodies，TSBAb)：具有阻滞TSH或TSAb对甲状腺的兴奋作用，抑制甲状腺滤泡细胞的生长，可引起甲状腺功能减低；(3)TSH结合抑制免疫球蛋白(TSH Binding inhibitorimmunoglobuLin，TBII)：与Graves病甲状腺外症状如突眼、胫前粘液性水肿有关。

鉴于TSHR在甲状腺滤泡细胞上的生理功能和在AITD发病中的重要作用，获得高亲和力的TSHR纯化蛋白已成为深入研究TSHR功能及其与TRAb作用的基础。而存在于甲状腺细胞膜上的TSHR数量少，结构不稳定，且难以纯化，因此对人TSHR基因进行分子克隆，建立体外表达系统对于AITD发病及临床治疗研究有重要意义。

人TSHR基因位于染色体14q31处，由2470bp碱基的开放读码框编码而成；其cDNA于1989年由Nagayama等成功克隆。目前，原核表达的人TSHR不能形成正确的自然构象及糖基化，亲和力低，应用受限。哺乳动物细胞可表达有功能的TSHR，但产量低。通过杆状病毒载体将hTSHR基因转入昆虫细胞可获得毫克数量的TSHR膜外区蛋白，但这些蛋白大部分不溶于水并且与TSH的结合率较低。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种人TSHR胞外段融合蛋白及其制备方法，利用分子生物学技术实现人TSHR胞外段融合蛋白在毕赤酵母系统的分泌表达，纯化以及对融合蛋白的活性检测。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种人TSHR胞外段融合蛋白，该融合蛋白是在人TSH受体蛋白胞外段的N端连接外源性分泌信号肽，在C端连接纯化标记序列。

所述的外源性分泌信号肽为酿酒酵母的α-factor因子。

所述的纯化标记序列为6×His的标记序列，通过能够被肠激酶识别的序列与TSH受体蛋白胞外段连接。

所述的肠激酶识别的序列与6×His标记序列之间还插入c-myc抗原决定簇序列。

所述的切除N端外源性分泌信号肽的人TSHR胞外段融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种人TSHR胞外段融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)以包含人TSHR基因的载体为模板，以引物对P为引物，PCR扩增人TSHR胞外段基因；所述的引物对P为：

上游引物P1：ccctcgagaa aagagggtgt tcgtctccac；

下游引物P2：gctctagagc atcatcatca tcttttctca ggaacttgta g；