[发明专利]一种人TSHR胞外段融合蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种人TSHR胞外段融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白是在人TSH受体蛋白胞外段的N端连接外源性分泌信号肽，在C端连接纯化标记序列。

2.如权利要求1所述的人TSHR胞外段融合蛋白，其特征在于：所述的外源性分泌信号肽为酿酒酵母的α-factor因子。

3.如权利要求2所述的人TSHR胞外段融合蛋白，其特征在于：所述的纯化标记序列为6×His的标记序列，通过能够被肠激酶识别的序列与TSH受体蛋白胞外段连接。

4.如权利要求3所述的人TSHR胞外段融合蛋白，其特征在于：在肠激酶识别的序列与6×His标记序列之间还插入c-myc抗原决定簇序列。

5.如权利要求4所述的人TSHR胞外段融合蛋白，其特征在于：切除N端外源性分泌信号肽的人TSHR胞外段融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

6.一种人TSHR胞外段融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以包含人TSHR基因的载体为模板，以引物对P为引物，PCR扩增人TSHR胞外段基因；所述的引物对P为：

上游引物P1：ccctcgagaa aagagggtgt tcgtctccac               ；

下游引物P2：gctctagagc atcatcatca tcttttctca ggaacttgta g  ；

2)将PCR扩增的人TSHR胞外段基因用Xho I、Xba I双酶切得到线性化的片段；并将该线性化片段与Xho I、Xba I双酶切的pPICZαA载体连接得到表达载体pPICZαA-hTSHRecd；

3)将表达载体pPICZαA-hTSHRecd转染到感受态的毕赤酵母，筛选得到目的片段阳性表达的阳性转化子；

4)将阳性转化子在BMGY培养基中28℃、250r/m条件下培养，当OD600达到2～6时，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬至OD₆₀₀为1.0诱导表达，每24h补加甲醇至终浓度为0.5％，28℃、250r/m条件下继续培养72h；

所述的BMGY培养基为：700ml去离子水中加10g酵母提取物和20g蛋白胨，高压灭菌冷却至室温后加入：100ml 1M磷酸缓冲液，100ml 10×酵母氮碱，2ml 500×生物素，100ml 10×甘油；

所述的BMMY培养基为：700ml去离子水中加10g酵母提取物和20g蛋白胨，高压灭菌冷却至室温后加入：100ml 1M磷酸缓冲液，100ml 10×酵母氮碱，2ml500×生物素，100ml 10×甲醇；

5)培养结束后，将重组酵母培养液室温12000r/m离心10min，取上清液于搅拌下加入硫酸铵至终浓度为50％；4℃条件下缓慢磁力搅拌4h，然后12000r/m离心30min，弃上清；所得沉淀物以50mM，PH7.4的PBS溶解，得到人TSHR胞外段融合蛋白浓缩液；

6)利用6×His标记序列识别的层析柱对人TSHR胞外段融合蛋白浓缩液分离，透析除盐后得到纯化的人TSHR胞外段融合蛋白。

7.如权利要求6所述的人TSHR胞外段融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的表达载体pPICZαA-hTSHRecd包含有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

8.如权利要求6所述的人TSHR胞外段融合蛋白的制备方法，其特征在于，表达载体pPICZαA-hTSHRecd转染感受态毕赤酵母为：

将酶切线性化的pPICZαA-hTSHRecd表达载体与感受态毕赤酵母混合后，滴加于0.1cm电转杯中，冰水浴5min，于电压1800V，电容25uF，电阻200欧姆条件下电击转化；

电击后，立即加入1mL浓度为1M预冷的山梨醇，混匀，30℃条件下静置2h，然后转移到含有zeocin的YPDS选择培养板上培养3～7d，待菌落出现后进行菌落PCR鉴定、western blot筛选表达人TSHR胞外段融合蛋白的阳性转化子。