[发明专利]一种甘蔗黄叶病毒两种基因型的鉴别方法

说明书

技术领域：

本发明属植物保护领域，尤其是一种快速、灵敏、特异性鉴别甘蔗黄叶病毒BRA和CHN1两种基因型的方法。

背景技术：

甘蔗黄叶病毒(Sugarcane Yellow Leaf Virus，SCYLV)侵染甘蔗引起甘蔗黄叶病，该病毒自1992年首先在夏威夷发现以来，现已蔓延至全球30多个国家和地区，2001年传至我国台湾地区，研究表明，该病已扩散至我国广东、广西、海南、福建和云南等蔗区。广西已将该病毒列为检疫对象。甘蔗黄叶病可引起甘蔗减产15％～20％，糖产量减少6％～14％，该病害已成为甘蔗生产中的重要限制因子之一。SCYLV仅分布于寄主韧皮部伴胞细胞质中，可通过种茎传播，病毒随带毒甘蔗种质资源的调运实现远距离传播。研究表明，该病毒不经机械摩擦传播，但可经高粱蚜、玉米蚜、甘蔗绵蚜等以持久性方式传播。在我国蔗区，甘蔗绵蚜发生普遍，因此该病害有大发生的可能。加强蔗区间引种的检疫，防止该病毒随种茎传入新的蔗区，可有效防止该病害的扩散、蔓延。

研究表明，甘蔗黄叶病毒存在丰富的遗传多样性，因甘蔗品种、传毒介体、环境条件及与病毒之间的相互作用，导致许多甘蔗黄叶病毒的分离物核苷酸序列存在很大的差异。在我国，侵染甘蔗的SCYLV主要以BRA基因型为主，另外也发现存在一个新的基因型CHN1，利用RT-PCR技术，根据BRA和CHN1基因型分离物序列设计各自基因型的特异引物对，建立基因型特异引物对RT-PCR技术以鉴别两种基因型，确定两种基因型在我国蔗区的分布，对病毒的检疫和抗病育种策略有重要指导意义。

发明内容：

本发明的目的是提供一种甘蔗黄叶病毒BRA和CHN1两种基因型的鉴别方法，快速、灵敏、特异性的鉴别甘蔗黄叶病毒BRA和CHN1基因型，相比测序可减少实验经费并节省时间。

本发明包括以下步骤：

1)RT-PCR引物设计：

根据GenBank数据库中已报道的代表甘蔗黄叶病毒BRA基因型的分离物SCYLV-A(登录号AF157029)序列和周国辉等在我国蔗区发现的代表CHN1基因型SCYLV-chn1序列。经序列比对，根据两种基因型代表分离物的序列差异，设计只可扩增BRA基因型分离物的特异引物对B1/B2，预期扩增片段为766bp；设计只可扩增CHN1基因型分离物的特异引物对C1/C2，预期扩增片段为448bp，引物序列如下：

BRA基因型特异引物对：

B1：5′GAAACCGATTTTGATAATCTGTC  3′

B2：5′CGGAGACTCATACACAAAATTA   3′

CHN1基因型特异引物对：

C1：5′GCTTCTCCCGGAGGTTCACT     3′

C2：5′TCGAGAACAACCTCCGCCTT     3′

2)甘蔗叶组织总RNA的抽提

采用H.Q.&.Q.溶液型RNA抽提试剂盒(安徽优晶生物工程有限公司)抽提新鲜叶片组织总RNA，具体步骤为：

(1)称取60mg新鲜甘蔗叶片放入已灭菌的研钵中，加入液氮研磨成粉末状后，迅速加入1mL Reagent，充分研磨混匀后，转至1.5mL灭菌的离心管中；

(2)向装有研磨混合液的离心管中加入200μL的氯仿，剧烈振荡15s，冰浴中放置10min；

(3)室温下，12000rpm，离心15min；

(4)取上清液(约400μL)转移至新的1.5mL灭菌的离心管中，加入500μL异丙醇后，漩涡混匀，室温静置10min；

(5)室温下，12000rpm，离心10min；

(6)弃上清，加入80％乙醇1mL，室温下，7500rpm，离心5min；

(7)弃上清，加入无水乙醇1mL，室温下，7500rpm，离心5min；

(8)残液用移液器吸出后，室温下，风干15min；

(9)加入100μL DEPC处理的灭菌ddH₂O，轻弹使充分溶解，稍离心后，置于-20℃的冰箱中备用，作为RT-PCR扩增的模板。

3)RT-PCR扩增

以抽提的甘蔗叶组织的总RNA为模板，分别用两对引物对RT-PCR进行一步法RT-PCR扩增，扩增抽提的甘蔗样品RNA，RT-PCR采用TaKaRa PrimeScriptOne Step RT-PCR Kit Ver.2(宝生物(大连)工程有限公司)试剂盒进行，具体步骤为：

引物对B1/B2反应体系：