[发明专利]一种甘蔗黄叶病毒两种基因型的鉴别方法

权利要求书

1.一种甘蔗黄叶病毒两种基因型的鉴别方法，其特征在于步骤如下：

1)RT-PCR引物设计：

根据GenBank数据库中已报道的代表甘蔗黄叶病毒BRA基因型的分离物SCYLV-A(登录号AF157029)序列和周国辉等在我国蔗区发现的代表CHN1基因型的SCYLV-chn1序列，经序列比对，根据两种基因型代表分离物的序列差异，设计只可扩增BRA基因型分离物的特异引物对B1/B2，预期扩增片段766bp；设计只可扩增CHN1基因型分离物的特异引物对C1/C2，预期扩增片段448bp，引物序列如下：

BRA基因型特异引物对：

B1：5’GAAACCGATTTTGATAATCTGTC  3’，

B2：5’CGGAGACTCATACACAAAATTA   3’，

CHN1基因型特异引物对：

C1：5’GCTTCTCCCGGAGGTTCACT  3’，

C2：5’TCGAGAACAACCTCCGCCTT  3’，

2)甘蔗叶组织总RNA的抽提：

采用H.Q.&.Q.溶液型RNA抽提试剂盒抽提新鲜叶片组织总RNA，具体步骤为：

(1)称取60mg新鲜甘蔗叶片放入已灭菌的研钵中，加入液氮研磨成粉末状后，迅速加入1mL Reagent，充分研磨混匀后，转至1.5mL灭菌的离心管中；

(2)向装有研磨混合液的离心管中加入200μL的氯仿，剧烈振荡15s，冰浴中放置10min；

(3)室温下，12000rpm，离心15min；

(4)取上清液(约400μL)转移至新的1.5mL灭菌的离心管中，加入500μL异丙醇后，漩涡混匀，室温静置10min；

(5)室温下，12000rpm，离心10min；

(6)弃上清，加入80％乙醇1mL，室温下，7500rpm，离心5min；

(7)弃上清，加入无水乙醇1mL，室温下，7500rpm，离心5min；

(8)残液用移液器吸出后，室温下，风干15min；

(9)加入100μL DEPC处理的灭菌ddH₂O，轻弹使充分溶解，稍离心后，置于-20℃的冰箱中备用，作为RT-PCR扩增的模板；

3)RT-PCR扩增：

以抽提的甘蔗叶组织的总RNA为模板，分别用两对引物对RT-PCR进行一步法RT-PCR扩增，扩增抽提的甘蔗样品RNA，RT-PCR采用TaKaRa PrimeScript OneStep RT-PCR Kit Ver.2试剂盒进行，具体步骤为：

引物对B1/B2的反应体系：

RNase Free dH₂O               20.0μL

2×1 Step Buffer              25.0μL

PrimeScript 1Step Enzyme Mix  2.0μL

B1(5μM)                      1.0μL

B2(5μM)                      1.0μL

RNA模板                       1.0μL

总体积                        50.0μL

引物对C1/C2的反应体系：

RNase Free dH₂O               20.0μL

2×1 Step Buffer              25.0μL

PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2.0μL

C1(5μM)                      1.0μL

C2(5μM)                      1.0μL

RNA模板                       1.0μL

总体积                        50.0μL

所述反应体系在冰浴中配制，反应程序：

4)电泳观察结果：

取5μL RT-PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶在0.5×TBE和90V的电压下电泳40min后，用BIO-RAD凝胶成像系统观察：引物对B1/B2扩增BRA基因型分离物可得到预期大小的目的条带，而CHN1基因型分离物、健康的甘蔗植株及清水对照中未扩增到任何条带；引物对C1/C2扩增CHN1基因型分离物可得到预期大小的目的条带，而BRA基因型分离物、健康的甘蔗植株及清水对照中未扩增到任何条带。